奥林巴斯荧光显微镜的解剖图

与基于宏观样本特征的其他光学显微镜模式相比，例如相位梯度，光吸收和双折射，荧光显微镜能够仅基于荧光发射的特性来成像单个分子种类的分布。因此，使用荧光显微镜，可以监测用特定荧光团标记的细胞内组分的精确位置，以及它们相关的扩散系数，转运特征和与其他生物分子的相互作用。此外，荧光对局部环境变量的显着响应使得能够研究活细胞和组织中的pH，粘度，折射率，离子浓度，膜电位和溶剂极性。

早的荧光显微镜配置采用经典的明场或暗场透射（透射光）光学系统，将通过滤光器的激发光聚焦到样品平面上。通过物镜收集荧光发射以及大量的激发照射，并通过第二滤光器投射到目镜光阑中以形成中间图像。因为激发光的强度通常比荧光发射大几个数量级，所以这些早期透射光显微镜中的样本视图通常对比度非常低并且叠加在充满散射激发照射的背景上。使用高数值孔径油浸暗场聚光器以高倾斜方位角照射样品有助于消除大部分背景噪声，但除了低数值孔径物镜外，没有提供足够的照明。产生的图像分辨率差，亮度非常低。

荧光显微镜与入射光（反射光或落射）照明初是在20世纪20年代后期开发的，用于观察不透明冶金样品中的荧光发射。与他们的明场对应物一样，这些反射光荧光仪器采用半反射式分束器，其总效率约为25％（每次通过镜子后失去50％的照度）。然而，反射光荧光显微镜享有具有作为聚光器的高数值孔径物镜的优点，并且能够产生比在相似数值孔径下操作的透射光显微镜具有显着更高水平的图像。此外，反射回物镜（在高数值孔径下）的杂散激发光减少到仅百分之几。物镜在反射光显微镜中的双重作用也显着简化了对准任务。仅将物镜聚焦到样品上建立了照明场和视场，使得入射的激发光和观察到的荧光发射遵循通过显微镜光学系列的相同路径。

当在20世纪30年代中期开发出紧凑型汞蒸气和氙弧放电灯时，照明光源的技术进步推动了反射光荧光（至少对于金相学）的转变。在此期间，有色玻璃和明胶过滤器也变得更加复杂，这使得能够使用卤钨灯应用由蓝色和绿色可见光激发的荧光染料。抗反射涂层和改进的玻璃配方在20世纪40年代导致了物镜设计的重大改进，但对入射光荧光显微镜发展的根本贡献是引入了二色分光镜（也称为二向色镜））由俄罗斯光学科学家Eugeny Brumberg于1948年开始。这项创新克服了在反射光显微镜中使用普通半反射镜所固有的光损失问题。反射光荧光显微镜初由Johan S. Ploem在20世纪60年代后期广泛商业化，他在开发Wild-Leitz Ploem Opak方面发挥了重要作用，其中包含多个可互换的光学模块，并装有各种荧光显微镜过滤器组合。

落射荧光显微镜的基本策略

反射光荧光显微镜绝大多数是用于非相干光源的宽场研究的当前选择方法，以及用激光扫描共聚焦和多光子仪器进行的那些。这种流行的荧光显微镜模式也称为入射光荧光，反射荧光或简单的落射荧光。典型的现代反射光荧光显微镜，也配备了各种对比度增强模式下的透射光观察，如图1所示。显微镜包含一个三目观察头，耦合到电荷耦合器件（CCD））摄像系统，有两个照明源，一个用于透射光，另一个用于观察观察（分别是钨 - 卤素和汞弧放电）。该设计的显微镜可以组合或交替反射光荧光与透射光相位对比度，微分干涉对比度（DIC），偏振光或霍夫曼调制对比度观察。

任何荧光显微镜的基本特征是提供用于激发样本的机制，其具有选择性过滤的照明，然后使用第二过滤器分离更弱的荧光发射，以在暗的背景上以大的灵敏度形成图像。在许多实验中，生物样本中的局部探针浓度非常低，只有一小部分激发光被荧光物质吸收。此外，在那些能够吸收一定量照射的荧光团中，发出二次荧光的百分比甚至更低。得到的荧光发射亮度水平将比照明的亮度水平低三到六个数量级。从而，荧光显微镜的基本问题是产生样品的高效照明，同时捕获与更强烈的照射带有效分离的弱荧光发射。在现代荧光仪器中通过基于二色分束器的作用和特性协调激发和发射要求的滤光器的组合来满足这些条件。

图2概述了在反射光荧光显微镜中二色分束器（镜子）功能背后的原理，其中包含荧光团的假想样品，该荧光团在绿色区域（550纳米）激发并发出红色（620至660纳米）波长的荧光。可见光谱。高强度光源以高通量密度（通常覆盖大部分紫外线和整个可见光谱）输出宽范围的激发波长，这些波长穿过照明器并首先遇到选择适当激发波段的滤波器（标记为EF; 见图2（a））。在这种情况下，滤光器以高效率通过波长在510和560纳米之间的光，但也允许其他波长以更小的程度通过。激发光接着到达二色镜（图2中的DM）并被反射到物镜后孔中以形成照射样品的锥形照明。双色镜位于光路中，呈45度角，设计用于选择性地反射490和565纳米之间的波长（如图3所示），同时传输更短和更长的波长。

图3中显示了用于将激发光照与图2中的荧光发射分开的滤光器组合的透射曲线。激发滤光片光谱（红色曲线）在510和560纳米之间显示出高水平的透射率（大约80％）。中心波长（CWL）535纳米。二色镜（黄色曲线）反射激发光谱区域中的波长，同时以相对高的效率通过更高和更低的波长。注意，二色镜像曲线上的百分比透射率对应于100％反射。在490和570纳米之间的透射分布中的显着下降（其表示反射率的峰值）用于反射从激发滤光器以90度角进入样品的波长带。光学系列中的后一个组件，即发射或屏障滤光器（白色曲线），透射高于590纳米的波长，这对应于具有黄色，橙色和红色的可见光。各种叠加光谱的透射和反射波段之间的边界被设计成尽可能陡峭，以确保反射和透射波长几乎*分离。在二色镜光谱中出现正弦上升和下降尖峰的图案是薄膜沉积过程的常见效果，称为响个不停。该滤波器组合的性能非常出色，清楚地证明了薄膜干涉滤波器技术的快速发展。

因为只有窄带宽的光被双色镜反射，所以设法通过激发滤光片的短于490纳米且长于565纳米的照射波长也通过二色镜传输，如截止上方的光所示。在图2（a）中。注意，激发光的反射不是100％有效，因此，少量绿光通过二色镜而不被反射。另外，并非所有波长大于565或小于490纳米的光都透过镜子。这种光的一小部分被镜子通过物镜反射到样品上。

由绿光激发产生的样品的荧光发射（主要是红色波长）由物镜聚集并通过二色镜和屏障滤光器（图2（c）中截止的光线以上）。屏障过滤器（标记为BF在图2中，专门设计为仅允许波长大于590纳米的光到达显微镜目镜和/或探测器。在用于此任务时，屏障滤光器有效地防止从样本反射的（并且成功地穿过二色镜）的激发光波长到达检测器。然而，从样品返回的大部分激发波长被二色镜（图2（c）中的截止光以下的光）反射到激发滤光器和发光器。图2和3中所示的滤光器配置的净效应是将强度明显更高的激发光与更弱的荧光发射分开。在所有情况下，如图所示，荧光显微镜中涉及的滤光片的截止水平不是的，但可以使波长范围外的一些光线渗透。图2（b）中以图形方式显示了整个事件序列，其中说明了有效反射光荧光显微镜所需的光学路径和策略滤波器布置。

垂直荧光照明器

现代荧光显微镜的核心是通用反射光垂直照明器，它插在观察观察管和携带物镜的物镜转换器之间，如图1和图4所示。照明器设计用于引导高光产生的光 - 通过首先使光通过显微镜物镜朝向样品的方向，然后使用相同的物镜捕获样品发出的光，将强度源置于样品上。这种类型的照明策略具有几个优点。显微镜物镜首先作为经过良好校正的聚光器，然后收集成像荧光发射，以便传输到目镜或相机检测系统。因此，物镜总是相对于每个功能正确对齐。此外，由样本散射或反射的大部分激发光（在360度角上）远离物镜前透镜元件，而不是直接投射到玻璃中，如透射荧光照射的情况。这种效应被称为正面照明，特别适用于厚厚的标本。后，被照射的标本区域被限制在被观察的相同区域，并且照明和光收集都可以利用物镜的全数值孔径。

在垂直照明器的远端是灯箱（见图4），其包含高强度电弧放电或灯丝基白炽灯光源。的照明光源是高压100瓦汞弧灯（HBO，通常称为燃烧器）但是，氙气和金属卤化物弧光灯，激光器和卤化钨白炽灯也可用于此目的。由光源发出的光由聚光透镜系统聚焦，并沿着平行于桌面并垂直于显微镜光轴的照明器内部行进。图4所示的发光器设计包含多组件收集器透镜系统，但也实施非球面透镜元件以改善近红外和紫外区域中的色差校正。设计用于去除或抑制红外波长的热过滤器放置在灯箱本身内部或邻近垂直照明器后部的灯箱安装座。此外，一些显微镜包含双频或多频激励平衡器灯箱附近的系统（见图4和图8）选择性地过滤激励不需要的波长，以微调包含在照明器另一端的荧光滤光器组的性能。

同样位于垂直照明器中灯箱附近的是一组中性密度滤光片，可用于调节通过系统的光的总强度并减少荧光褪色或光漂白。这些过滤器通常安装在滑块框架上，使其能够在观察样品荧光的同时快速插入光路并从光路中移除。为了建立Köhler照明，垂直照明器包含一个可居中的光圈和视场光阑组合，两者都有可变的光圈孔径，决定了场的大小和照明强度。通过位于垂直照明器壳体的每个外侧上的几对旋钮实现孔径和场光阑的对中以及光圈尺寸的调节。在某些设计中，提供一个滑块旋钮，从光路中移除整个光圈组件，以大化通过照明器的光量。其他显微镜包含固定尺寸的针孔，安装在滑块上，可插入光路，大大限制照明场，适用于特殊应用，如光漂白后的荧光恢复（FRAP）调查。

在垂直照明器光学系列中的场光阑和光阑之后是场透镜，它是扩散光并产生足够的照明场以建立科勒照明所必需的。在场镜之后，所有现代垂直照明器都包含一个光闸（具有手动开关控制），当没有观察或记录荧光时，它阻止强烈的激发光到达滤光片组和样品。快门是荧光显微镜的一个关键特征，因为样品的连续照射可以显着减少由于光漂白引起的发射，而高强度光对于活细胞是不健康的。此外，快门使电弧放电灯保持活动状态（减轻预热时间），同时用透射光瞬间检查标本。荧光显微镜通常配备电子快门，可快速远程控制照明。防紫外线护罩（标有图4中的呼吸遮光罩安装在照明器外壳的前部，以保护操作员在快门打开时不会意外泄漏潜在危险的短波紫外线辐射。通过在观察时保护标本免受呼出气体，护罩起到双重作用。

几种垂直照明器设计提供了用于矩形偏振器框架的槽，其可用于荧光偏振研究。在大多数情况下，将偏振器插入场镜后面的照明光路（远离共轭平面），但是在光闸之前（见图4）。偏振器可以用预定的透射方位固定到位，或者安装在齿轮组上，允许通过使用指轮改变透射轴的方向。由于偏振器安装在滑动框架中，因此在不使用时可以很容易地从光路中移除。随附的分析仪（荧光各向异性测量所需的第二个偏振器）可以安装在滤光块转塔上方的垂直照明器中，或在专门设计的偏光显微镜中间管中。辅助管通常能够插入渐变的旋转偏振器单元，以确保分析器透射方位相对于偏振器和显微镜光轴的精确定位。

垂直照明器的后一级包含一个旋转转台或滑动支架，其中装有包含荧光滤光器组合的光学块。当需要使用特定荧光滤光器组合成像时，滤光器块旋转（或滑动）到光学系列中。单个块包含一组匹配的激发和发射滤光片，以及二色分光镜，所有这些都经过精心定位，以大限度地提高样品照射和捕获特定波长的荧光发射。光学块转塔和滑块支架可以装载三到六个单独的块，其中一个位于光路中，而其他块在临时存储中旋转或滑出。当观察用两个或更多荧光探针标记的样本时，这些附件能够在荧光滤光片组之间快速转换。在配备有荧光照明器的显微镜中使用透射照明通过装配在转台或滑块支架上的槽中的虚拟光学块来促进。虚拟块阻止激发发射（当快门打开时），但不包含任何滤光器并允许光从物镜不受阻碍地通过观察管。

在标准模块化直立显微镜中，垂直照明器位于显微镜框架和观察管之间（见图1）。许多制造商提供可插入照明器和目镜单元之间的中间管，用于偏振器，DIC棱镜或其他附件。现代显微镜框架通常是计算机辅助设计努力的结果，其导致显着的减振和增强的人体工程学特征。合成材料，如金属基陶瓷和铝复合材料，可显着提高框架的静态和热刚性，从而使仪器能够承受*荧光技术的严苛要求，这些技术需要在长时间内*消除振动用于成像弱荧光发射。

Köhler荧光显微镜照明

在荧光垂直照明器中，光源被定位成使得细丝或电弧放电等离子体球位于聚光透镜的主焦点附近。在Köhler照明中，灯聚光透镜起到显着增大的辅助光源的作用，以增强整体照明。Köhler照明的主要要求之一是灯丝或电弧的图像必须终投射到物镜的后焦平面上，在反射光照射的激发期间，它也是（通常是高数值孔径）聚光器的两倍。理想情况下，光源应填充整个物镜孔径，以大化辐射强度并产生均匀照射的场。在某些情况下，热点）。但是，由于扩散滤光片也会降低照度，因此应尽可能避免使用。

在反射光Köhler照明（图5中示意性地示出）中，光源的图像被聚光透镜聚焦到位于垂直照明器中的孔径光阑膜片上。该光阑与物镜的后孔和灯弧或灯丝共用共轭平面，因此确定照射的场孔径尺寸。光源，垂直照明器孔径光阑和物镜后焦平面（光瞳）一起形成共轭平面的照明组。与透射光显微镜的情况不同，孔径光圈和光源被成像到物镜（充当聚光器）后孔径平面上，而不是物理地位于该位置。作为此配置的附加好处，当物镜提供激发照射或由聚集的荧光发射形成图像时，所有障碍物（例如虹膜光圈）都从光路中移除。打开或关闭孔径光阑用于控制杂散光并调节照明的强度（数值孔径）而不改变照明场的大小。在图像中，孔径光阑的调整会影响亮度和对比度。

反射光Köhler照明中的共轭平面的成像或场组由场光阑，样品表面和中间图像平面组成。因此，当场光阑在样品平面处聚焦时，光源的图像显着地从焦点移除，以便提供均匀的照明场。视场光阑控制照射场的大小而不影响被观察区域的照明强度。在实践中，场光阑开口尺寸应该尽可能小，以便增加图像对比度并减少未被直接观察的区域中的光漂白程度。尽管大多数电弧放电和灯丝光源产生的照明强度不均匀，但Köhler照明可以均匀照射样品场。正确配置显微镜后，物镜的后焦平面*照亮，从边缘到边缘提供均匀明亮的区域。在理想情况下，Köhler照明用一组会聚的波前对样本进行沐浴，每个波前都是由光源上的单独点形成的，这些点被成像到聚光器孔径中。在正确配置的荧光显微镜中，结果是的图像对比度和分辨率。在理想情况下，用一组会聚的波前对样本进行沐浴，每个波前都是由成像到聚光器孔径的光源上的不同点产生的。在正确配置的荧光显微镜中，结果是的图像对比度和分辨率。在理想情况下，用一组会聚的波前对样本进行沐浴，每个波前都是由成像到聚光镜孔径的光源上的不同点产生的。在正确配置的荧光显微镜中，结果是的图像对比度和分辨率。

光源和灯塔

对于荧光显微镜中的严格定量分析，样品照射必须在整个视野中在时间上和空间上恒定。随时间的不稳定性通常反映由于电源输出变化而发生的灯辐射的波动。相反，在弧光灯中出现的空间扰动来自称为闪烁的现象因为等离子体球在电极上来回移动。闪烁通常由电源波动，电极电阻的小变化或机械振动产生。基于灯丝的光源，例如流行的卤化钨灯，在使用稳压电源的恒定直流电下工作时非常稳定。通常，光源应选自其光谱含量，与物镜后孔径区域相比的灯丝尺寸，空间和时间稳定性以及场照明的均匀性。还必须特别注意光源的强度，因为激发滤光器通过的窄带波长仅包括总发光器输出的非常小的部分。

选择用于荧光显微镜的光源的主要考虑因素是与所研究的荧光染料的量子产率和吸收相关的紫外和可见光光谱分布。此外，光源必须与捕获图像所用探测器的灵敏度兼容，无论是人眼，传统胶片，光电倍增管，增强型视频管还是数码相机系统。选择还取决于照明模式。使用电弧放电或钨 - 卤素源满足宽场荧光显微镜要求，而共聚焦和多光子显微镜需要适应各种激光系统。钨和钨 - 卤素白炽灯的使用取得了有限的成功，因为它们的大部分发射发生在光谱的红色和红外区域，而大多数荧光团被紫外，蓝色和绿色波长激发。此外，电弧放电灯的光输出比通常用于透射光照射的12伏石英卤素灯亮10到100倍。宽视场荧光显微镜的光源是水银弧光灯，它通常包含在基本模型显微镜配置中。在某些情况下，使用氙和金属卤化物弧光灯，但这些通常局限于光谱和强度分布与特定荧光团要求相匹配的特殊情况。

汞和氙灯的设计类似，除了灯泡外壳中的物理尺寸和气体。汞灯包含两个在高压下密封在石英玻璃灯泡中的电极，该灯泡还含有汽化的元素汞。当电源通电时，一系列高压脉冲被发送到电极，电离一小部分汞气，点燃灯。在烧制之后，电压降低并且电离气体用于承载电流并产生在两个电极之间形成的等离子体球。在灯工作期间，汞的蒸发在玻璃灯泡内产生大量的热量和压力，终产生高强度的光。汞弧灯产生的光线即使在紫外线和可见光谱范围内连续，集中在365,400,440,546和580纳米的离散波长。从紫外线到红外线，氙灯在整个光谱范围内具有更均匀的强度分布。荧光染料的选择对于确定荧光显微镜的适当光源至关重要。一些荧光探针具有与突出的水银线重合的激发带，而其他荧光探针受益于氙灯的更均匀分布的照射。

荧光显微镜中弧光灯的正确对准对于实现科勒照明并避免荧光图像中的明暗区域至关重要。因此，灯箱的质量通常可以通过正确的灯对准的稳定性和用于保持对准的调节旋钮的效率来判断。灯座应配备灯对中螺钉，以使弧形图像在物镜后孔中居中，并且灯箱应包含红外滤光器，以阻挡远红色和红外线中的长波长，从而产生大量的热量。一些灯箱设计有一个内置的红色抑制滤波器（例如，Schott BG38），或者用于这种过滤器的槽，以消除在某些应用中通过视野看到的带红色背景。此外，灯箱本身不应泄漏有害的紫外波长，并且优选地，如果在操作期间无意中打开壳体，则应该包括开关以自动关闭灯。后，灯箱应足够坚固，以承受运行期间可能的燃烧器爆炸。

荧光显微镜应用的广泛多样性通常需要一系列光源以满足特定荧光团和成像条件的要求。在一些情况下，与超灵敏相机系统组合可能需要非常低的辐射，而对于其他研究，可能需要强激光激发以杀死活细胞或选择性地漂白荧光团。波长要求通常跨越光谱的整个可见区域，以及紫外线和红外线的部分。由于单个光源无法满足这些多种照明要求，因此制造商现在提供的适配器可以将两个或多个灯同时连接到单个显微镜上。

荧光滤光片组合

如前所述，穿过垂直照明器的透镜和光阑的光终遇到容纳在光学块中的激发滤光器，该光学块定位成与照明器光路和显微镜光学系统之间的轴向交叉点重合。激发滤光器从灯产生的宽光谱中选择一个窄带波长，并将它们传递到二色镜，而二色镜又将光反射通过物镜并照射到样品上。在固定目镜光阑中形成图像之前，由物镜聚集的荧光发射再次通过二色镜和发射或屏障滤光器。用于在宽场荧光显微镜中分离波段的常用滤波器包括彩色玻璃滤光片和干涉薄膜滤光片（或两者的组合）。为荧光显微镜照明和成像方案中的每个步骤确定合适的过滤器可能会造成混淆，因为涉及大量过滤器制造商，每个过滤器制造商都为荧光文献提供了专有的字母数字命名法。

图7中示意性地示出了典型荧光激发块的解剖结构，以及二色镜，激发和屏障滤光器的相关光谱轮廓。过滤块通常由制造商提供的定制工具组装，因此操作员可以互换过滤器和二色镜。激发和屏障过滤器通过固定夹，光学胶或圆形螺纹安装座固定到位（参见图7）。通常，可以在不打开光学块的情况下移除这些滤光器，因为它们位于平坦外表面上的凹陷孔上方。更换二色镜更加困难，需要*拆卸块才能进入内部。大多数砌块部分采用45度对角接头铸造，通过保护内部并以适当的角度支撑二色镜，可实现双重任务。拆下将块体部分固定在一起的紧固件（销钉或小螺钉）后，可以通过松开或移动固定夹来取下镜子，然后小心地将其从块体中取出。应小心处理二色镜，因为干涉涂层通常不受保护且容易划伤。供应显微镜公司的几家过滤器制造商也提供各种售后过滤器和二色镜，适用于各种荧光应用。拆下将块体部分固定在一起的紧固件（销钉或小螺钉）后，可以通过松开或移动固定夹来取下镜子，然后小心地将其从块体中取出。应小心处理二色镜，因为干涉涂层通常不受保护且容易划伤。供应显微镜公司的几家过滤器制造商也提供各种售后过滤器和二色镜，适用于各种荧光应用。拆下将块体部分固定在一起的紧固件（销钉或小螺钉）后，可以通过松开或移动固定夹来取下镜子，然后小心地将其从块体中取出。应小心处理二色镜，因为干涉涂层通常不受保护且容易划伤。供应显微镜公司的几家过滤器制造商也提供各种售后过滤器和二色镜，适用于各种荧光应用。

荧光滤光片设计包括长通，短通（边缘滤光片），以及窄带，中带和宽带带滤光片系列。图7中示出的光谱示出了几种常见滤波器轮廓的示例。图7中的发射滤波器光谱（蓝色曲线）由具有约575纳米的截止波长的长通干涉滤波器产生。较长的波长通过滤波器传输，而较短的波长被阻挡。来自同一组的窄带通激发滤波器（红色曲线，图7）具有约20纳米的带宽，而二色镜（绿色曲线）具有近似中等（455-490纳米）的透射区域和宽带通滤波器（560） -775纳米）。因为二色镜有效地用作绿色中的长通滤波器，可见光谱的黄色和红色区域（560至700纳米），在滤光片组中对其进行处理。关于如何利用荧光团吸收和发射光谱分布来选择合适的荧光显微镜滤光片组的工作知识对于成功实施该技术是*的。

二色镜（或分束镜）是荧光显微镜滤光器组合中关键的部件，类似于长通干涉型滤光器，其制造为具有多层介电材料的公差。二色镜和标准干涉滤光器之间的主要区别在于，镜子专门设计用于在限定的边界波长下进行反射和透射，并且必须相对于显微镜和发光器光轴以45度角操作。将二色镜定位成使干涉涂层面向激发光源，以便通过光学系统以90度角反射短的激发波长到样品。同一镜子也必须充当透射滤光器，以将长波长荧光发射从物镜传递到像平面。因为几乎全反射和大透射之间的波长过渡区域通常仅限于20或30纳米，所以二色镜能够精确地区分激发和发射波长。

设计荧光滤光器组使得特定激发波长带与二色镜中的反射区域精确匹配。结果是激发光通过显微镜有效地反射到样品上。样品的荧光发射必须与二色镜中的高透射区域匹配，以使这些波长能够通过检测器。屏障滤光器在整个方案中不太重要，但仍然在确保消除散射和反射的激发波长，来自靶以外的探针的荧光和由于自发荧光引起的一般背景强度方面起重要作用。创建滤波器组的重要因素是确保传输，反射，所涉滤波器的发射曲线与相应区域的发射曲线相匹配。否则，激发波长可能能够通过二色镜并使图像模糊，或者荧光发射可能无意中在镜子处反射以损害图像亮度。

即使在看似完美匹配的滤波器组合中，也可能发生各个滤波器的光谱分布之间的轻微重叠，从而降低性能。特别值得关注的是激发滤光器和二色镜之间的串扰，这使得一些激发光能够通过镜子并从滤光器块的壁反射。如上所述，以高倾斜角度反射的光可以部分地透过屏障滤光器，以降低图像对比度。这种通过过滤器的泄漏称为渗透或交叉实际上所有滤波器组合都或多或少地发生。过滤器制造商和显微镜公司关注的主要领域之一是改进荧光滤光器组合的设计，以降低交叉水平。

荧光滤光片组的几种配置如图8所示。滤光片块转塔（图8（a））包含五个块，可以在滤光片组合之间快速转换，同时研究至少这一数量的荧光团。其中一个转塔槽通常填充有虚拟光学块或留空以用于透射光观察。使用激励平衡器（图8（b））微调激发光谱以成像双重或多重标记的样品，其中包含安装在旋转接头上的单个干涉滤光片。旋转激励平衡器的调节杆使滤光器的带通透射区域移动到更短的波长。从而，当平衡器滤光器从零度入射角（垂直于垂直照明器轴）旋转到大旋转角度45度时，滤光器的带通区域可以移动25到50纳米之间的值。激发平衡器可以单独使用或串联使用以改变观察下的荧光染料的激发带宽，以使发射强度相等。该特征使得能够微调含有几种探针的样本中的荧光团强度，例如，减少来自一个探针的荧光发射，同时增加另一个探针的强度。激发平衡器可以单独使用或串联使用以改变观察下的荧光染料的激发带宽，以使发射强度相等。该特征使得能够微调含有几种探针的样本中的荧光团强度，例如，减少来自一个探针的荧光发射，同时增加另一个探针的强度。激发平衡器可以单独使用或串联使用以改变观察下的荧光染料的激发带宽，以使发射强度相等。该特征使得能够微调含有几种探针的样本中的荧光团强度，例如，减少来自一个探针的荧光发射，同时增加另一个探针的强度。

薄膜涂层技术的快速发展可以通过在单个干涉滤光器中产生多个透射峰值以及在二色镜中制造交错的反射和透射带的能力来证明。当适当匹配时，可以组合两个多波段滤光片和二色镜，以产生多个荧光滤光片组，其能够同时激发和观察几个荧光团的发射。过滤器组可从制造商处获得，适用于同一样品中的两个，三个甚至四个荧光团。多个滤波器组的主要问题是它们的费用以及当来自一个荧光探针的发射通过用于另一个的带通区域时发生的过量的交叉或渗透。在一些样本（和滤镜组）中，渗透对背景强度和图像对比度具有显着影响。许多研究人员倾向于使用优化的滤光片组分别对每个荧光团成像，随后将图像组合成复合物。

*的荧光技术通常需要使用具有单个二色镜的多个激发和发射滤光器。为了便于这些研究，许多荧光显微镜配备了电动滤光轮或滑块，多包含六个单独的滤光片（见图8（c））。设计用于滑块的显微镜或者在垂直照明器中包含用于插入滑块的特殊槽，或者过滤器滑块可以代替通常包含中性密度滤光器的滑块。在一些显微镜设计中，垂直发光器也可以容纳发射滑块，或者安装在发光器和观察管之间的辅助中间管以容纳滑块。在直立和倒置显微镜中，包含激发滤光器的电动滤光器单元通常夹在中性密度滤光器和灯箱之间的垂直照明器光学通路中。同样，电动发射滤光片单元在垂直显微镜设计中放置在垂直照明器和目镜观察管之间，但通常通过与用于倒置器械的检测器相同的外部端口连接。激励和发射滑块和电动滤光轮对于使用单个双色镜的双重和三重激励应用非常有用。通过消除在观察单个样本时重新定位过滤块的需要，这些附件使研究者能够获得图像之间的准确配准。

荧光显微镜的物镜

在所有形式的反射光显微镜（包括荧光）中，图像强度是物镜数值孔径和放大率的函数。实际上，强度或亮度（定义为每单位面积和时间的光子通量）增加了数值孔径的四次方，但是仅与放大率的平方成反比：

其中NA是物镜数值孔径和M.是放大倍数。从这种关系中可以明显看出，亮的荧光图像将由具有高数值孔径和低放大率（例如0.75 / 20x）的物镜聚集。例如，数值孔径为1.4的60x计划复消色差油浸物镜理论上会产生比相同数值孔径的100倍物镜更亮的图像，但需要考虑折衷。增加内部透镜元件的数量（与数值孔径物镜一样）会产生自发荧光和来自内部透镜表面的强度减少反射的相应增加。通常，制造商在其推荐的荧光显微镜物镜中做出校正因子和增加的光透射之间的折衷。

一般来说，高数值孔径油（1.3至1.4）和水（1.2）浸入计划萤石和平面复消色差物镜由于其巨大的聚光能力而产生亮的荧光图像。这些物镜表现出优异的色彩校正，因此能够将多种荧光发射波长聚焦在同一平面内。复消色差和萤石物镜的透光特性在低至约350纳米时是*的，这是检查在紫外区域中激发的荧光染料（例如DAPI，Hoechst，Alexa Fluor-350和AMC）的要求。尽管有许多内部镜头，但这些物镜是由具有抗反射涂层的低荧光玻璃制成，以大限度地减少背景荧光并产生非常高对比度的图像。

专为特殊应用而设计的物镜广泛用于荧光显微镜。这一类包括高数值孔径水浸，多次浸泡（油，水和甘油），以及具有石英透镜元件的紫外物镜。对于活细胞成像应用，需要具有校正环的长工作距离物镜，以便通过厚（0.5-2毫米）培养瓶壁观察样品。通过具有非常长的焦距（工作距离）的物镜促进厚的试样深处的检查，这些物镜可以从几个制造商处获得，用于通过空气或水覆盖眼镜成像。设计用于没有盖玻片的长工作距离水浸物镜也具有Teflon前锥，因此可以将物镜浸入水溶液中。对于在20至30毫米（包括约5毫米水）的工作距离下在水中的紫外激发（340纳米）产生类似的物镜。对于相对较低的放大倍率研究，建议使用具有*数值孔径（0.75至0.95）的20倍水浸物镜。虽然非常昂贵，但这些物镜在荧光团浓度和/或量子产率微不足道的情况下产生极其明亮的图像。

荧光显微镜配件

制造商不断为其仪器生产有用的附加配件单元，以增加荧光显微镜中不断增长的成像应用的可用选择。例如，在一些显微镜上可以选择矩形场光阑（见图9），它可以限制被照射的样品区域，以提高对比度并减少光漂白。模块化现场光阑代替垂直照明器中的传统光圈光阑（也是可拆卸模块），设计用于匹配数字成像传感器的纵横比。矩形场停止提高了科勒照明的效率，降低了电子传感器的信噪比。作为额外的好处，在反卷积研究中使用可编程扫描阶段时，可以调整图像矩形大小以与阶段步长一致。针孔类似于矩形场光阑，可用于需要高度受限照明场的应用。

其他配件包括双灯外壳适配器，可使两个光源（如水银和氙弧放电灯）同时连接到垂直照明器。适用于激发激光的照明器也可用于全内反射荧光（TIRF），荧光寿命成像显微镜（FLIM）等应用），比率成像和光漂白恢复实验。此外，主要制造商提供的大多数研究级荧光显微镜很容易适应各自的激光扫描共聚焦配件。直立式显微镜通过三目观察管接受共焦扫描单元，而倒置仪器可将光束扫描仪连接到显微镜框架的侧面或后端口。插入垂直照明器和观察管之间的双端口可用于引入额外的光源或将荧光引导到多于一个检测器。大多数这些装置都配有可选的C型安装适配器或标准显微镜端口配件。

设计用于电生理学研究的荧光显微镜已变得非常复杂。许多都配备了专门的减震级，可以接受各种微操纵器配件，用于使用荧光，红外差分干涉对比（IR-DIC）的实验）和传统的明场对比度增强成像技术。摆动物镜转盘可实现物镜的快速无振动交换，以防止在对活细胞和组织成像时干扰标本或气泡的侵入。使用新的高数值孔径长工作距离2x和4x微距镜头（物镜）可以在生物体中进行荧光宏观观察，这些镜头配备有专门的滤光片组合块。此外，一些制造商还提供荧光垂直照明器和滤光片组作为其立体显微镜的附件。

垂直照明器有时可选择1.25倍至1.5倍的放大系数作为选项，但由于引入空放大的固有问题，应尽可能避免使用辅助镜头进入荧光图像。几种模块化垂直照明器设计包括用于连接包含在照明器上方的多个摄像机端口的分束器模块以增加成像能力的装置。考虑到现在可用于荧光显微镜的各种电动附件，包括物镜转盘，聚光镜，滤光轮和平台，研究人员可以获得比以往更复杂的成像技术。制造商在许多复杂荧光应用的配件设计中投入了大量精力，这些应用曾经只能使用来自各种来源的*件构建的显微镜。随着荧光显微镜成为细胞生物学，神经生理学和临床领域越来越重要的工具

倒置荧光显微镜设计

类似版本的垂直荧光照明器可用于倒置（组织培养）显微镜支架。倒置支架还允许反射光荧光和透射光显微镜的各种对比度增强技术之间的组合或交替。研究级倒置显微镜具有多个（多六个）输入/输出端口，通常在框架的每一侧有单个端口，以及后部的一个或两个端口（上部和下部）和底部下方的底部端口显微镜 在某些型号中，可以从三个或更多端口同时获得主图像，而无需使用中继镜头。这种连接水平使得可以使用多个光源，滤光轮和相机系统进行复杂的荧光分析。用于倒置显微镜的汞和氙灯罩可与标准的多元件或非球面聚光透镜一起使用，以提高性能并减少紫外和红外光谱区域的像差。此外，可以使用各种灯箱适配器来连接多个照明源，类似于可用于直立显微镜的附件。

图10中显示了现代倒置（组织培养）荧光显微镜的剖面示意图，该显微镜配备有Peltier冷却的CCD图像传感器和传统的35毫米胶片相机系统。尽管胶片相机的用途有限，但大多数倒置显微镜仍然在前底座的下部包括用于这些附件的端口。图10中所示的显微镜可以使用安装在支柱上的钨 - 卤素灯箱来执行传统的明场透射照明（具有或不具有对比度增强）。汞或氙弧放电灯用于荧光显微镜，使用连接到特殊配置的后端口的反射光照明器。孔径和场光阑，以及中性密度滤光片，在显微镜后部的端口附近进入。在一些倒置显微镜模型（未示出）中，包含可对中隔膜的L形反射光照明器可用于改善对后辅助端口的访问以用于附加附件。图10中通过显微镜的光路以黄色表示透射光，紫色表示未过滤弧光灯照明，绿色表示滤光荧光激发，红光表示荧光发射。

现代倒置显微镜框架，如同它们的直立对应物，是由计算机设计和制造的复合材料，用于结构和热稳定性。此外，机械平台部件和电路结构设计具有短行程距离和高刚性，以避免在例如DIC棱镜插入或物镜校正环的调整等常规操作中操纵物镜转向器时的俯仰和偏航。*的物镜转盘架阶段能够在延时和长时间的荧光观察中实际消除焦点漂移。标准立式显微镜不具备的其他舞台选项包括滑动和360度旋转舞台，玻璃舞台插板，加热板，培养皿和板支架以及二氧化碳培养箱。

具有模块化设计的倒置显微镜可以容易地配置用于电生理学，体外受精，显微操作，高分辨率DIC，视频增强观察和各种*荧光技术的研究。这些仪器也很容易适用于共聚焦和多光子显微镜。电动配件包括百叶窗，滤光轮，旋转物镜转盘，荧光块转盘，聚焦驱动器和聚光镜。当与高工作距离，水浸，紫外激发和相位对比的高级物镜相结合时，所有都具有高度光学校正，倒置显微镜是进行活细胞和组织荧光研究的理想仪器。

结论

在荧光显微镜中，样品内局部荧光团浓度之间的广泛变化，加上从一种荧光染料到另一种荧光染料的消光系数和量子产率的差异，显着影响对于给定量的激发强度产生的发射信号。考虑到许多样本在任何特定视场中仅包含微量的荧光材料，这些组合因子产生的平均荧光发射水平比激发强度小4到6个数量级。此外，还有一些更复杂的荧光技术，如原位杂交和共振能量转移（FRET），发射信号强度可以比激发的发射信号强度小9到10个数量级。为了补偿激发强度和发射强度之间的这些大的差异，现代荧光显微镜必须能够在不干扰荧光信号的情况下将激发照射衰减超过十亿次。

荧光显微镜的主要特征之一是对特征波长吸收和发射光的荧光探针的高特异性，导致该技术能够在复杂混合物中以非常低的浓度选择性地检测物镜物种。此外，荧光的高灵敏度和空间分辨率使得能够在显微镜的光学分辨率以下的长度尺度上精确定位和研究单个分子。局部环境因素也严重影响荧光发射，因此该方法是pH，粘度，离子浓度，分子距离和取向，膜电位，疏水性，电荷分布和扩散系数波动的理想探针。荧光的时间分辨率限于激发的荧光探针的寿命，其可以是纳秒级。由于许多生物过程发生在这个时域，衰变动力学可以揭示有关细胞过程的动态信息。总的来说，这些因素在荧光显微术应用于细胞生物学中至关重要。

在过去十年中，荧光显微镜以惊人的速度发展，同时在激光技术，固态探测器，干涉薄膜制造和基于计算机的图像分析方面同样迅速发展。高数值孔径水浸物镜的发展进一步有助于生物现象的研究，使研究人员能够在其自然环境中深入探测活细胞。随着显微镜制造商对研究界不断变化的需求做出回应，*的荧光仪器和配件的开发无疑将继续发展，它们对探索自然神秘的终贡献可能终具有深远的意义。