奥林巴斯荧光显微镜优化和故障排除

荧光显微镜的一个关键特征是它能够检测到相对于黑暗（通常是黑色）背景有时微弱可见或甚至非常明亮的荧光物体。为了优化该特征，必须使用将在该部分引物中讨论的原理来大化图像亮度和分辨率。

图像亮度 - 优化图像亮度的重要方面之一是确保为样品提供足够的光能，以便在适当的波长下激发附着在样品上的每个发色团。同样重要的是选择适当的屏障过滤器以大化指向观察管或摄像管的发射荧光量。诸如汞和氙燃烧器的高能光源将在非常窄的近紫外和可见光范围内提供大量的激发能量。当这些光源的使用耦合到能够传输所选波长同时阻挡那些不希望的激发滤波器的适当选择时，将满足激励的标准。

防止不需要的波长进入观察管的阻挡滤光器的选择是主要关注点。激发的总能量远远大于发射能量，因此选择一种有效的屏障滤波器非常重要，它可以阻挡不需要的波长，同时允许样品的荧光发射通过。选择用于荧光的物镜必须能够在近紫外区域和整个可见光谱中有效地透射光。

鉴于发光水平较低，物镜在荧光显微镜中的作用至关重要，因为它是从样品中收集光的物镜功能。物镜接受的光锥角度由物镜的数值孔径（NA）决定，如图1所示。在透射光荧光显微镜中，到达眼睛或其他探测器的光强度直接变化为物镜和聚光器的数值孔径的平方与总放大倍数的平方成反比。

另一方面，在反射光荧光中，图像的强度直接随着使用物镜的数值孔径的四次方而变化，并且与数值总放大率的平方成反比：

这种差异是由于物镜初用作聚光灯，用于将光线聚集在样品上，然后作为通常的光线收集器用于图像形成。其含义是显而易见的：高数值孔径物镜将产生比具有较低数值孔径的相同放大物物镜具有更高强度的图像。例如，在其他条件相同的情况下，NA为1.0的40X物镜将产生比数值孔径为0.65的40X物镜亮5倍以上的图像。进一步的暗示是，如果可能的话，与更常用的10X观察目镜相比，使用较低放大率的视觉目镜（例如8倍放大率）也将增加图像的亮度。另外，在反射光荧光中，激发光仅通过物镜（在其作为聚光镜的功能）集中在被观察的区域上。结果，激发光的强度远高于透射光暗场荧光，其中被激发的区域随着物镜的改变而不改变。同样在暗场中，物镜的数值孔径必须减小到低于聚光镜的数值孔径，以保持视场的暗度。

除了数值孔径是一个重要的考虑因素之外，建议具有质量的色度校正的物镜，因为在同一平面中的各种颜色的聚焦将产生更清晰的图像。此外，球面校正越好，图像越清晰。因此，选择的物镜是平场复消色差物镜或平场荧光物镜。这些应设计成当用400纳米波长的光（近紫外光）照射时，透镜元件及其粘固剂本身不会自发荧光。

在可能的情况下，应采用油浸物镜，以尽量减少玻璃载玻片和盖玻片表面反射造成的光损失。现代显微镜制造商努力提供*不含自发荧光污染物的光学元件，但也应考虑这一方面，因为自发荧光会通过增加背景亮度来降低样品对比度。

图像分辨率 - 显微学会（RMS）标准厚度，适用于0.17mm的玻璃盖玻片。由于制造过程中的波动，在盖玻片的统计抽样中，该数量存在轻微的变化（通常在0.01mm和0.03mm之间）。高数值孔径“干"物镜容易受到这些变化的影响，并且许多物镜都配有校正环允许显微镜师微调玻璃厚度的物镜校正。购买高度精确的盖玻片并确保物镜校正项圈得到调整非常重要。此外，一些制造商提供包含内部可变光阑的物镜，如图2中的100X复消色差奥林巴斯物镜所示。如果使用的物镜是使用的，则应通过适当调节该可变光阑（图2）来小化眩光。如此装备。

使用油浸物镜时，在使用后用纸巾擦拭前镜片以去除油污，并确保定期用适当的溶剂清洁（通常每月约一次就足够了）。浸没物镜上留下的过多油会吸收空气中的灰尘并降低图像质量和分辨率。此外，确保浸油不含PCB，具有非常低或不存在的自发荧光水平，并应用于物镜 - 盖玻片界面而不形成气泡。

应仔细调整显微镜的光路，以确保所有组件都按照设计正确放置和执行。如我们对荧光显微镜光源的讨论中所述，光源弧应正确对准。

清洁光学元件 - 荧光显微镜（以及所有其他形式的显微镜）的条规则是保持光学元件*没有灰尘，污垢，油，溶剂和任何其他污染物。显微镜应保存在低振动无烟室内，尽可能清洁并且对循环空气的干扰小。不使用时，请在显微镜上使用防尘罩，并将所有配件放在不透气的容器中。避免使用腐蚀性溶剂清洁显微镜的任何部分，并仅使用稀释的肥皂水清洁非光学表面。应使用以下提示保持物镜清洁：

• 切勿以高压力（包括镜头纸）在镜头表面上拖动任何物体，以避免在表面上引入非常细小的划痕。

• 使用专为光学表面设计的溶剂清洁镜头，或在紧急情况下使用无水乙醇清洁镜头。避免使用其他溶剂，因为它们可能会与玻璃上的光学涂层反应。

• 在用溶剂清洁之前，用压缩气体对镜头表面进行除尘，以去除松散的颗粒。

• 用镜头清洁剂或乙醇浸泡Q-tip，并在镜片上轻轻擦拭几次，每次通过前转动棉签。用镜头纸擦去多余的溶剂，让镜头*干燥。重复此过程。

如上所述，可以用溶剂清洁油浸透镜。切勿使用含干燥物镜的油，因为清洁干燥物镜可能比专门设计用于油的物镜要困难得多。

进一步的优化和故障排除 - 在理想情况下，所有显微镜检查都应在黑暗的房间内进行，但这对荧光显微镜尤为重要。人眼很难快速适应黑暗，在房间变暗后很难立即辨别出一个非常昏暗的荧光标本。在不查看或拍摄样品时，通过阻挡激发光来避免样品过度漂白。在安装之前，通过*清洗样品以去除多余的荧光染料，大限度地减少自发荧光。有关一般问题解决和故障排除的其他方面，请参阅下面的表1。

表格1

荧光标本的显微照相呈现出一些在光学显微镜中*的*挑战。虽然相机系统参数保持不变，但必须更加注意曝光细节和诸如由于极长曝光时间而发生的互易失效之类的伪像