奥林巴斯显微镜荧光激发和发射基础概述

由于其新颖的电子配置，荧光染料具有*和特征的吸收光谱（通常类似于激发）和发射。这些吸收和发射光谱显示相对荧光强度，相对强度在纵轴上经典绘制，而在横轴上为波长。对于给定的荧光染料，制造商指出照射激发强度的峰值的波长和荧光发射强度的峰值的波长。重要的是要了解显示给定荧光染料的激发和发射光谱的图和曲线的来源。

为了确定特定荧光染料的发射光谱，确定大吸收的波长（通常与激发大值相同）并且在该波长下激发荧光染料。典型荧光染料的吸收光谱如图1（a）所示，其中吸收的相对强度相对于测量的波长作图。然后使用单色器（允许窄带光波长通过的装置）扫描整个发射波长系列上的荧光发射强度。在各种波长下测量荧光的相对强度以绘制发射光谱，如图1（b）所示。该激励通过监测大强度波长的荧光发射，同时荧光团通过连续的波长组激发，以类似的方式确定给定荧光染料的光谱。选择发射大值，并且仅允许该波长的发射光通过检测器。在各种激发波长下诱导激发（通常通过单色器），并测量发射荧光的强度作为波长的函数。结果是曲线图或曲线（如图1（a）所示），其描绘了激发波长谱上的激发产生的相对荧光强度。

可以从典型的激发和发射曲线或光谱组中进行若干观察。在激发光谱的较高波长端和发射光谱的较低波长端之间通常存在重叠。必须通过适当选择激发滤光片，二色分束器（反射光荧光）和阻挡或发射，在荧光显微镜中消除激发和发射强度和波长的重叠（如图1（c）所示）。过滤。否则，更亮的激发光会淹没较弱的发射荧光并显着降低样本对比度。

当电子从激发态进入基态时（参见下面标题为分子解释的部分），振动能量就会丧失。结果，发射光谱偏移到比激发光谱更长的波长（波长与辐射能量成反比）。这种现象被称为斯托克斯定律或斯托克斯移位。斯托克斯位移越大，将激发光与发射光分离越容易。发射强度峰值通常低于激发峰值，并且发射曲线通常是激发曲线的镜像，但是移位到更长的波长。为了获得大荧光强度，通常在激发曲线的峰值处的波长处激发荧光染料，并且在发射曲线的峰值波长（或观察者选择的其他波长）处选择发射检测。激发波长和发射波长的选择由适当的滤波器控制。在确定光学系统的光谱响应时，

典型的荧光染料吸收 - 发射光谱图如图2所示。注意，吸收的荧光强度曲线（通常类似于纯化合物的激发曲线）和这种典型荧光染料的发射曲线在形状上有些相似。激发和发射之间的波长偏移自19世纪中叶以来就已为人所知（斯托克斯定律）。还要注意，激发和发射曲线在激发的上端和发射曲线的较低波长处稍微重叠。

激发和发射波长的分离是通过适当选择滤光片来阻挡或通过光谱的特定波长来实现的，如图3所示。荧光照明器的设计基于通过易于更换的滤光片插入控制激发光和发射光在朝向样品的途中进入光路，然后从样品中散发出来。考虑到低发射强度，重要的是选择用于激发的光源具有足够的亮度，使得相对弱的发射光可以大化，并且选择具有令人满意的吸收和产率的荧光染料。

荧光染料吸收激发光的效率称为消光系数。消光系数越大，在给定波长区域中光吸收的可能性越大（确保荧光发射的先决条件）。发射光的产率被称为量子产率，发射的量子（“能量包"）的数量与吸收的量子数量的比率（通常产率在0.1和0.9之间）。量子产率低于1是通过非辐射途径（例如热或光化学反应）而不是荧光的再辐射途径损失能量的结果。下表1中列出了一组选定的荧光染料的荧光量子产率。

荧光色素荧光量子产率

表格1

消光系数，量子产率，光源的平均发光强度和荧光寿命都是影响荧光发射强度和效用的重要因素。此外，荧光染料周围的局部环境在确定荧光发射特征中起着至关重要的作用。诸如溶剂粘度，离子浓度，pH和环境中的疏水性之类的变量可以对荧光强度和激发态的寿命产生深远的影响。

荧光的分子解释

荧光活性有时以图解方式描绘，如图4（a）所示（称为Jablonski能量图）。在激发之前，分子的电子构型被描述为处于基态。在吸收通常具有短波长的激发光的光子时，电子可以被提升到更高的能量和振动激发态，该过程可能仅花费十亿分之一秒（通常被称为飞秒的时间段，10E- 15秒）。

在荧光中，在大约万亿分之一秒（皮秒或10E-12秒）的间隔期间，受激电子可能会失去一些振动能量到周围环境并返回到所谓的低激发单重态。从低激发单重态开始，电子能够“弛豫"回到基态，同时发射荧光，如图4（a）所示。发射的光总是具有比激发光（斯托克斯定律）更长的波长，并且只要激发光照射荧光样品就继续发射。如果激发的激发辐射停止，则荧光停止。

偶尔激发的电子，而不是通过振动相互作用放松到低单重状态，进行禁止过渡在辐射发射可能显着延迟到几秒或更长时间的过程中，离开三重态然后到达基态。这种现象是磷光的特征，如图4（b）所示。在一些情况下，受激电子可以从三重态返回到低激发单重态，然后返回基态，随后发射荧光。这种作用比通常的荧光需要更长的时间（大约一微秒或两微秒），称为延迟荧光（图4（c））。在其他情况下（例如，光漂白或重金属或其他化学品的盐的存在），发射的光可以显着减少或*停止，如下所述。

褪色或光漂白

有一些特定条件可能会影响激发荧光团对光的再辐射，从而降低荧光强度。这种发射强度的降低通常称为褪色或光漂白。一些作者进一步将褪色细分为淬火和漂白。由于在分子氧存在下的光强度，漂白是荧光分子的不可逆分解。猝灭还导致荧光强度降低，并且经常由于氧化剂或重金属或卤素化合物的盐的存在而产生。

通常，猝灭是由于能量转移到物理上靠近激发的荧光团的其他受体分子，这种现象称为共振能量转移。这种特殊现象已成为测量远低于光学显微镜横向分辨率的距离的新技术的基础。

漂白的发生导致了一种称为FRAP的技术，或光漂白后的荧光恢复。FRAP基于短激光爆发的漂白和随后观察荧光团扩散到漂白区域引起的荧光恢复。

流行抗褪色试剂的性质

表2

为了降低某些样品的褪色程度，建议在光照到达激发滤光器之前在光路中使用中性密度滤光片，从而减小激发光强度。在其他情况下，可以通过改变封固剂的pH或通过使用抗漂白剂来减少褪色效果（表2中列出了几种更重要的试剂）。对于数字成像，显微照相或简单的视觉观察，快速改变视野也可以避免褪色效应。