NR2B、 p ERK、 p Elk21 共同参与大鼠逃避性学习和记忆

摘要 　目的: 探讨 NR2B2p ERK 2p Elk21 途径是否参与了大鼠各学习记忆相关脑区 Y 2迷宫逃避性学习和记忆。方

法: 健康雄性成年 SD 大鼠 45 只 ,共分为 4 组: ①ifenprodil 腹腔注射组（ifenprodil ip ,14 只） , ②DMSO 腹腔注射组

（DMSO ip ,15只） ; ③ ifenprodil脑室注射组（ifenprodil ic ,8只） ; ④ DMSO脑室注射组（DMSO ic ,8 只） 。以 Y迷宫训

练和测试成绩作为行为学评定指标 ,用免疫组织化学和 Western blot 方法观察大鼠学习记忆相关脑区p ERK1/ 2 和

p Elk21 的变化。结果: Ifenprodil ip 组与 DMSO ip 组动物的 Y迷宫学习成绩没有明显差异（ P > 0. 05） ,但 ifenprodil

ip 组 Y迷宫记忆成绩差于 DMSO ip 组（ P < 0. 05） 。腹腔注射 ifenprodil 导致 Y迷宫训练后各脑区 p ERK1/ 2 和

p Elk 21 表达的普遍下降 ,其中以海马、边缘区、杏仁核zui为明显 ,与 DMSO ip 组相比差异有显著性（ P < 0. 05） 。

Ifenprodil ic组与 DMSO ic组*次 Y迷宫测试成绩没有明显差异（ P > 0. 05） 。*次测试后立即脑室给药并在

给药后 6 h测试 Y迷宫记忆再巩固成绩 ,发现ifenprodil ic组成绩下降 ,与 DMSO ic组相比有明显差异（ P < 0. 05） ,

而且ifenprodil ic组动物各脑区的p ERK1/ 2和p Elk21 表达与 DMSO ic组相比均普遍下降 ,其中p Elk21 表达在尾壳

核和边缘区几乎*消失。结论: NR2B对于大鼠 Y迷宫长期记忆的形成、记忆再巩固过程是必要的 ,NR2B 的失

活将破坏这些过程。同时 NR2B的失活减弱了 Y迷宫训练后及记忆再巩固测试后学习记忆相关脑区p Elk21 和

p ERK1/ 2表达 ,其中在尾壳核和边缘区 ,NR2B的失活使记忆再巩固测试后p Elk21 表达*被阻断。

关键词: 　NR2B ; 　 p ERK; 　 p Elk21 ; 　学习和记忆; 　信号转导; 　大鼠

在神经元中 ,胞外信号反应激酶（ext racellular

response kinase ,ERK）途径在调节细胞存活和神经

元可塑性中起重要作用。ERK下游靶目标包括突

触可塑性所必需的转录因子 CREB ,Elk21 等。神经

元中 ERK活性被多条胞外信号途径的信号分子所

调节。NMDA 依赖的 ERK蛋白激酶的激活需要包

含有 NR2B 亚基的受体通道的开放和 Ca

2 +

的进入。

Ifenprodil 作为一种 NMDA 受体拮抗剂 ,可以

非典型性非竞争性地选择性结合于NR2B 亚单位的

*结合位点 ,从而选择性地阻断含有 NR2B 亚

基的 NMDA 受体的作用。NR2B 亚基特异的 NM2

DA受体抑制剂 ifenprodil 以 3μmol/ L 的浓度即可

抑制培养的海马神经元中 60 %的 NMDAR电流 ,同

时也使 70 % NMDAR 依赖的 ERK 的激活受到抑

制[1 ]

。本实验即是通过对大鼠训练前腹腔注射

ifenprodil 和记忆测试后脑室注射 ifenprodil 来观察

Y迷宫学习记忆行为的变化并用免疫组织化学和

Western blot 方法观察ifenprodil 对 Y迷宫训练后大

鼠各学习记忆相关脑区p ERK1/ 2 和p Elk21 表达 的

影响 ,以探讨 NR2B、 p ERK1/ 2、 p Elk21 信号通路是

否参与了 Y迷宫行为模式的学习记忆及记忆的再巩固。

1 　材料与方法

1. 1 　动物

健康雄性成年 SD大鼠 45 只 ,购自*军医大

学实验动物中心。体重 200～300 g。保持光照/黑

暗12 h循环恒定 ,食物由实验中心提供 ,饮用自来

水。

1. 2 　实验分组

动物共分为 4 组: （ 1） ifenprodil 腹腔注射组（ifenprodil ip ,14 只） ; （2） ,DMSO 腹腔注射组（DM2

SO ip ,15 只） ,此2 组中分别有7 只动物在训练后立

即处死 ,用来进行免疫组织化学染色; （3） ifenprodil

脑室注射组（ifenprodil ic ,8 只） ; （4） DMSO 脑室注

射组（DMSO ic ,8 只） ,分别在记忆测试后立即给与

脑室注射。

1. 3 　手术与给药

腹腔注射动物在训练前 15 min 给药。将 ifen2

prodil 溶于二甲基亚砜（DMSO）中 ,浓度为 1. 2 mg/ml ,注射量 3 mg/ kg ;DMSO腹腔注射组注射同样体

积DMSO。

脑室注射组动物在第 2 d 记忆测试后立即经腹

腔注射 10 %*（0. 4 ml/ 100 g） ,固定于脑立

体定位仪上 ,双侧脑室钻孔（坐标:前囟后 1. 6 mm ,

中线两侧 2. 0 mm ,深 3. 5 mm） ,将药物通过玻璃电

极垂直缓慢注入 ,并留针 10 min。Ifenprodil 溶于

DMSO中 ,浓度为 2. 0μg/μl ,每侧注射 0. 5μl ;DM2

SO脑室注射组注射同样体积DMSO。

1. 4 　电 Y迷宫中厌暗逃避反射训练电 Y型迷宫三条臂的尽头均有一灯 ,底部是电

网 ,实验时其中有一条臂末端的灯发出亮光 ,此时该

臂底部电网无电流通过 ,为安全区;另两臂末端的灯

不亮 ,底部电网通电（约 50～70 V） ,为非安全区。

安全区与非安全区随机改变。每当大鼠到达安全区

30 s 后再随机改变安全区的位置 ,转变 5 s 后非安

全区底部电网即有脉冲电流通过 ,刺激正常大鼠足

底而驱使其跑向安全区。大鼠在 10 s 内从非安全

区一次性跑向安全区即被判为正确 ,否则均判为错

误。*天训练在每只大鼠上重复 60 次 ,记录正确

次数。少于 25 次视为不合格 ,弃去并及时补充动

物。ifenprodil ip 组及其对照 DMSO ip 组在训练前15 min腹腔注射。训练结束 24 h 后（第二天）进行

Y迷宫测试 30 次 ,记录正确次数。ifenprodil ic 和

DMSO ic组在 Y迷宫测试后立即进行脑室注射 ,并

在 6 h 后测试动物 Y迷宫记忆的再巩固。

1. 5 　免疫组织化学标本取材和染色

腹腔注射组动物进行第二天测试后立即腹腔内

注射 10 %*（4 mg/ 100 g）麻醉动物。经主

动脉 4 %多聚甲醛灌注固定。冠状冰冻切片 ,厚度

35μm。常规ABC法染色 ,一抗分别为兔抗单克隆

p ERK1/ 2 抗体（1∶ 200 , Cell Signaling Technology 公

司）和兔抗多克隆p Elk21 抗体（1∶ 100 ,Cell Signaling

Technology 公司） 。采用硫酸镍铵增强的二氨基联

苯胺（ GDN）法显色。阴性对照用正常二抗同源血

清代替一抗 ,其它步骤相同。

1. 6 　数据的采集

p Elk21 免疫阳性神经元使用 scion image 图像

分析系统 ,每只动物每个脑区选取 5 张切片 ,每张切片选择一个代表性视野在 200 倍光镜下检测平均光

密度。每只动物所选取切片层面基本相同 ,zui后计

算每组大鼠每个脑区 p Elk21 免疫阳性神经元平均

光密度。p ERK1/ 2 免疫阳性细胞计数在 Olympus显微镜 100X 物镜下进行 ,每只动物所取切片层面

基本相同 ,数目相同 ,各脑区均取 5 张连续切片 ,获

得该区阳性神经元均数 ,zui后计算每组大鼠每个脑

区p ERK1/ 2 免疫阳性神经元平均数。

1. 7 　Western blot

脑室注射组记忆再巩固测试后立即断颈取脑 ,

置干冰上分离嗅球、前额叶、尾壳核、边缘区、海马、

小脑组织。低温匀浆 , 4 ℃, 10 000 ×g 离心 1 h ,

Bradford法测蛋白浓度 ,变性后 - 80 ℃保存。SDS2

PAGE电泳:8 %分离胶 ,5 %分离胶 ,电泳完毕在半

干电转仪上将蛋白转移至硝酸纤维膜上 ,常规蛋白

免疫印迹染色 ,一抗分别为兔抗 p ERK1/ 2 抗体（1∶

1 000 ,Cell Signaling Technology 公司）及兔抗 p Elk21 抗体（1∶ 1000 ,Cell Signaling Technology 公司） ,zui

后采用硫酸镍铵增强的二氨基联苯胺（ GDN）法显

色。Scion Image图象处理软件分析各泳道p ERK1/

2和蛋白条带光密度（OD）值以及各自的参照泳道

OD值。计算待检测泳道 p ERK1/ 2 和 p Elk21 泳道

与各自相应的参照泳道的 OD比值。

1. 8 　统计学处理

所有数据以均数 ±标准差（ … x ±s）表示 ,统计分

析软件采用 SPSS13. 0 ,组间分析采用 one2way

ANOVA。2 　结果

2. 1 　训练前腹腔注射ifenprodil 对大鼠 Y迷宫学习

及 24 h 后 Y迷宫记忆的影响　　

训练前 15 min 腹腔注射 ifenprodil 组动物的 Y

迷宫学习成绩与 DMSO ip 组相比 ,没有明显差异

（ P > 0. 05） ,但是在 24 h 后测试动物的 Y迷宫记

忆 ,ifenprodil ip 组成绩差于 DMSO ip 组成绩（ P <

0. 05 ,表 1）

Tab. 1 　Effect of ifenprodil peritoneal injection before t raining

on rat Y 2maze memory（ Times , … x ±s）

Group Number

Y 2maze score

Training Test

Ifenprodil ip 7 35. 42 ±5. 74 17. 71 ±2. 69 3

DMSO ip 8 35. 00 ±3. 66 21. 75 ±3. 692.2　 训练前腹腔注射ifenprodil 对各学习记忆相关脑

区pERK1/ 2和pElk 21表达的影响

Y迷宫训练后立即取标本检测两组大鼠pERK1/ 2

和pElk 21在各脑区的表达差异