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基于Obitrap超高分辨质谱平台的多肽药物特立帕肽的定量分析

2020年12月02日 14:41人气：1281 来源: 赛默飞色谱及痕量元素分析 >> 进入该公司展台

　　前言：多肽药物是介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子药物之间的一类重要的药物分子，因其生物活性高、靶向专一性高、选择性高、毒副作用低等优点而被广泛应用于疾病治疗领域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率，质量轴稳定性，已经广泛应用在了多肽药物结构表征中。Obitrap 作为高分辩还具有*灵敏度和线性范围，因此也被越来越多的应用到药物的定量研究中 [2,3]。

　　PTH 是甲状旁腺主细胞分泌的由84个氨基酸组成的多肽类激素，其对于维持钙磷代谢的稳定起着至关重要的作用。特立帕肽(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，4117.7 Da)是一种人工重组合成的人PTH 1-34多肽，是第yi个被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的抗骨质疏松性骨折的骨合成药物 [3]。 Thermo Scientific Q Exactive Focus 四极杆 Orbitrap 组合型质谱仪专为常规分析应用而设计，高分辨率为7万，大分辨率12Hz，可以在同一系统中同时实现准确可靠的定性和定量分析。 Obitrap Fusion Lumos是赛默飞世尔科技在2015年推出的三合一的静电场轨道阱超高分辨质谱仪。Lumos搭载的分段式四级杆技术(Advanced Quadrupole Technology，AQT)使离子传输效率至少提高了 2 倍，超高场的Obitrap拥有50万分辨率和 20Hz的超快扫描速度，使Lumos在具有高灵敏度同时，还拥有稳定性和动态范围。本实验将基于两款Obitrap高分辩质谱Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽药物特立帕肽的定量分析方法，考察高分辩质谱Obitrap的定量能力。

　　实验条件样品配置：称取特立帕肽粉末，加水稀释成5mg/mL的标准品储备液。用含5%乙腈，0.1μg/μL BSA，1%甲酸的稀释剂，逐级稀释特立帕肽标准品，配置成标准曲线。色谱条件：液相系统为：Thermo Vanquish Flex液相色谱仪，色谱柱为Thermo AccucoreTM 150 C18(50×2.1mm，2.6um，货号16126-052130) ；柱温：45℃；流动相及梯度系统程序见表1

　　血浆样品前处理：取150μL的人空白血浆，加入15μL的特立帕肽工作液，震荡混匀。按体积比1:6加入含75%乙腈，0.1% FA的沉淀剂后，充分震荡。6500g离心5min，取上清后，40℃挥干。挥干样品用150μL含10% ACN，90%水，1% FA的复溶剂复溶，充分震荡，14000g离心5min，取上清，上样5μL进行分析。数据分析：所有数据分析均使用Thermo Scientific™ TraceFinder™ 软件完成。TraceFinder平台包含了仪器控制，方法开发，数据定性定量批处理等功能。提峰时质量偏差为±5ppm。实验结果 1、特立帕肽标准品在Focus，Lumos上的线性与准确度。用稀释剂(含0.1ug/μL BSA，1% FA，5% ACN)的稀释剂逐级稀释特立帕肽标准品，配置成一系列浓度标准品，上样分析。结果表明，Focus对特立帕肽的定量下限为50 pg/mL(图1)，上样5μL，上柱约60 amol，标准曲线线性良好，R2=0.997，标准曲线各点回算的浓度在理论值的15%以内(表4)。

　　特立帕肽的LOQ点在Focus和Lumos上的提峰图如图3，峰型良好，信噪比S/N>10，重复5针的RSD<10%(表6)，表现出了良好的稳定性。

　　2、特立帕肽血浆样品在Lumos上的线性与准确度。同时在Lumos上考察了特例帕肽血浆样品的定量下限。取150 μL的空白人血浆，加入一系列浓度梯度的特立帕肽标准品，配置成血浆标曲，用1:6体积的75% 乙腈沉淀后，离心去上清，挥干，复溶后进样。结果显示，Lumos对于基质复杂的血浆样品仍表现出良好的线性，精密度，稳定性。特立帕肽低定量下限为50 pg/mL，线性范围50 pg/mL-50 ng/mL(图4)，1000倍的线性范围，上柱量约60 amol，标曲各点Diff值 < 10%(表7)。

　　结论：本文分别在Obitrap Focus赛默飞四极杆-轨道阱质谱仪，Lumos上建立了大分子多肽类药物特例帕肽的定量分析方法。结果表明，高分辩Obitrap对特立帕肽表现出良好的定量能力，定量下限可以分别达到上柱60 amol，24 amol。同时，对于基质更为复杂的血浆样品，Lumos 上可以达到定量下限上柱60 amol，灵敏度满足临床上对特立帕肽的检测要求。Obitrap作为高分辨质谱，在拥有超高分辨率的同时，兼具出色的灵敏度和稳定性，可以应用大分子多肽类药物的定量分析与检测。

　　参考文献 [1] Lau J L, Dunn M K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions[J]. Bioorganic & medicinal chemistry, 2018, 26(10): 2700-2707. [2] Dillen L, Cuyckens F. High-resolution MS: first choice for peptide quantification?[J]. Bioanalysis, 2013, 5(10): 1145-1148. [3] Kang L, Weng N, Jian W. LC–MS bioanalysis of intact proteins and peptides[J]. Biomedical Chromatography, 2019: e4633. [4] Quattrocchi E, Kourlas H. Teriparatide: a review[J]. Clinical therapeutics, 2004, 26(6): 841-854.

（本文来源：赛默飞色谱及痕量元素分析，转载请注明出处）

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