D3030L1411 Quick Cell 外泌体提取试剂盒

Quick Cell 外泌体提取试剂盒的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。李记生物自主开发的外泌体快速提取试剂盒，组分经过优化处理，适用于细胞培养上清液、血清、血浆、尿液及其他体液（脑脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等）中的外泌体提取，并搭配纯化过滤装置，可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒。

Quick Cell 外泌体提取试剂盒

Quick Cell 外泌体提取试剂盒产品描述
   外泌体是由细胞分泌的包含RNA和蛋白质的小囊泡（20-200 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能，在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子；然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。
 外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。李记生物自主开发的外泌体快速提取试剂盒，组分经过优化处理，适用于细胞培养上清液、血清、血浆、尿液及其他体液（脑脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等）中的外泌体提取，并搭配纯化过滤装置，可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒。
本试剂盒处理单位样品成本仅为国外同类产品的1/6-1/3，经上海市计量测试技术研究院检测，本试剂盒与国外产品提取纯化相同样品所得的外泌体，没有显著差异。
试剂盒组成

       *RNase/DNase Free, Sterile

Quick Cell 外泌体提取试剂盒运输与保存条件

常温运输，室温条件下质保期24个月，使用前充分混匀。

Quick Cell 外泌体提取试剂盒使用方法

1.条件准备 

①高速离心机(可达10000g离心力)；2mL、50mL(或15mL)离心转子；1.5mL，50mL(或15mL)离心管；② 1×PBS缓冲液。

2.样品预处理

①样品准备：如果是冻存样品，从冰箱取出后于25℃水浴中进行解冻，将*融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

②离心去除细胞碎片，将样品转移至离心管中，在4℃，3000 g条件下离心10 min，取上清转移到新离心管中。

③离心去除其他杂质，*次离心收集的上清液，在4℃，10000 g条件下离心20 min，取离心上清液转移到新的离心管中备用。

注：本试剂盒盒可处理多种样品，处理量因样品种类不同而有差异。单次提取可处理的不同样品量范围见下表。

表1.单次提取可以处理的不同样品量的范围（单位：mL)

3.提取外泌体

①上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS试剂）；部分粘稠的样品（血清、血浆、乳液、唾液等）需先加入预冷的与样品等体积的1×PBS进行稀释，之后再加入ECS试剂，试剂用量如下表，表中样品为举例值，其他剂量样品根据表中的试剂用量等比例调整。

表2.外泌体提取试剂用量表（单位：mL）

②溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，上下颠倒离心管10-20次，再放置于2℃至8℃静置过夜（10 h-12 h）；

③沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

④外泌体重悬：取400μL 1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其均匀悬浮在PBS中后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中；

⑤收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。

4.纯化外泌体

①纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosomoe Purification Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；

②外泌体的保存：纯化后的外泌体以50 -100μL进行分装，分装后的外泌体保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

常见问题

Q1：粘度大的待测样本如何处理？

A1：待测样品粘度过大时，可将样本用4℃预冷的1×PBS缓冲液进行等体积稀释处理。

Q2：收获的外泌体颗粒无法通过EPF柱纯化时怎么处理？

A2：由血清、血浆、唾液等样品收获的外泌体浓度较高，此时可用4℃预冷的     1×PBS进行稀释后再通过EPF柱离心。

Q3: 外泌体如何保存？

A3：纯化完成后的外泌体可50 μL-100 μL分装后保存于-80℃备用。

Q4：如何鉴定提取的外泌体？

A4：通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行Western blot检测时，通常检测外泌体标志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101等）。

Q5：培养细胞时，血清来源的外泌体怎么去除？

A5：多数情况下，细胞在体外培养需要血清，但血清中含有外泌体，为了避免血清污染细胞产生的外泌体，一般采用2种方法：

①细胞培养前，通过100000×g超速离心过夜，去除血清外泌体。

②可选择无血清培养基进行培养。

Q6：细胞培养过程中死细胞是否会影响外泌体的提取？ 

A6：会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，细胞zui终会裂成碎片，它们在外泌体的纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体，同时有可能会堵塞EPF纯化柱。

Q7：本试剂盒如何保存？

A7：室温保存，无需低温保存。

Q8：本试本剂盒能否分离纯化200-1000nm直径的囊泡吗？

A8：不能，本试剂盒不能用于直径大于200nm囊泡的分离。

Q9：本试剂盒适用于哪些种类样品中的外泌体提取？

A9：除细胞上清液外，本试剂盒还可用于尿液及其他低密度体液（如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌体提取。

Q10：本试剂盒提取过程会用到哪些仪器和耗材？

A10：低温高速离心机、涡旋振荡器（Vortex）、水浴锅、移液器、离心管（1.5mL、50mL）。

Q11：样品在提取外泌体之前是否可以低温保存？

A11：可以。*请保存于-80℃，无须加冻存液；短期（1-2天内）则保存于4℃即可。

Q12：无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？

A12：细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

Q13：准备做细胞外泌体Small RNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？

A13：普通肿瘤细胞系*使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先通过10kD超滤柱浓缩，准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

Q14：加了ECS液离心之后无沉淀，这个现象正常吗？

A14：由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，加了ECS液离心之后肉眼可能无法观察到沉淀，在重悬时使用PBS液朝离心管离心外侧的内壁反复吹打洗脱即可（避免剧烈吹打）。针对提取后的外泌体*行NTA粒径检测或BCA蛋白定量检测，再决定是否进行后继实验。

Q15：在纯化过程中，EPF柱为什么会出现堵塞现象?

A15： 该现象有可能是因为细胞培养时间过长产生很多细胞碎片(样品离心预处理时不充分，仍有细胞碎片残留)，建议细胞培养24-48h左右收集上清液。

Q16：EPF柱是否可以多次使用？

A16：不能重复使用。过量的样品会超出纯化柱的使用极限，影响分离效果。

Q17：提取的外泌体进行Western blot前是否需要加入RIPA试剂裂解？

A17：需要，一般按照1:1的比例加入RIPA试剂。

Q18：进行外泌体Western blot鉴定时有无内参蛋白可供选择？

A18：无，该检测属于定性检测。

Q19：组织细胞外泌体如何提取？

A19：无菌环境下将*成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养12h；将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中；先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再按照本试剂盒说明书提取外泌体。