针对SARS-CoV-2刺突蛋白的治疗性抗体可保护脆弱人群远离严重或具有潜在威胁的疾病，这在帮助缓解当前肺炎疫情大流行中发挥着重要作用。冷冻电子显微镜(cryo-EM)是一种强大的仪器，可用于绘制阻断SARS-CoV-2病毒入侵的抗体表位图[1]。通过解析SARS-CoV-2和抗体结合的表位，可以使我们能够了解它们之间的作用机制，并增加我们对抗体如何赋予保护性免疫力的认知。此外，对抗体表位和作用机制的精确了解，也可以指导抗体疗法的改进，生产新的抗体治疗药物。例如，冷冻电镜解析了刺突蛋白和不同抗体的非重叠结合表位，从而促进了 “抗体鸡尾酒” 疗法的研发，降低了病毒逃逸的风险[2]。
 

　　目前， 肺炎疫情大流行的主要原因之一是SARS-CoV-2 不断变异，新变异毒株可能逃避免疫。其中一个便是Omicron(B.1.1529)变异株，在其与受体结合区域 (receptor-binding domain) ，含有迄今为止最多的突变位数量。刺突蛋白和抗体结合的表位结构，能快速识别刺突蛋白脆弱位点，并预测和解释新突变可能带来的影响，还能加快针对非重叠结合表位的抗体组合决策选择效率。此外，关于表位的结构信息，可以帮助确定新的药物研发管线，以应对新出现的变体。因此，如何使用冷冻电镜加速抗原抗体表位筛选成为我们所考虑的问题之一。
 

　　在这里，我们将探讨如何通过 Thermo Scientific™ EPU 软件 的EPU Multigrid收集功能将 cryo-EM 用于高通量表位作图。在本研究中，我们从 12 种临床前阶段抗体中，生成并表征了一组针对受体结合域的特异性SARS-CoV-2中和抗体。这组抗体代表了一系列 SARS-CoV-2 抗体的中和效力、亲和力及其余六种粗表位库。这六种抗体表位库中，大部分抗体来自 肺炎 患者，另一些来自人抗IgG 动物的免疫接种。在此， 我们展示了如何从为期 2 天的无人值守冷冻电镜中，在12 个含有不同 Fab 的spike-Fab复合物的载网上获得12个优于3  Å的刺突蛋白结构(图 1)。
 

　　图1. 使用EPU Multigrid在200kV Glacios Cryo-TEM上实现的SARS-CoV-2刺突蛋白抗体的高通量冷冻电镜表位图。
 

　　我们使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接电子检测相机对SARS-CoV-2刺突蛋白进行单颗粒分析。在此实验中，在1.5小时内收集了28,162个颗粒，并计算重构了一个3.1埃的刺突蛋白膜外区结构(图2)。
 

　　图2. 使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接电子检测相机对SARS-CoV-2刺突蛋白进行单颗粒分析。右图，代表包含搭建原子结构的密度图(PDB ID：6XR8)。
 

　　EPU Atlas Screening用于收集总共24个载网的图像，并从中选出12个最佳的载网进行数据采集。EPU Multigrid可以通过使用 "Max Exposures "选项限制每个载网拍摄的图像数量来进行筛选工作。为了衡量我们的12个载网是否具有解析高分辨结构的质量，我们在Glacios Cryo-TEM上使用EPU Multigrid，为每个spike-Fab复合物收集50张图像。将这些小数据集在cryoSPARC Live软件中进行预处理[3]。在获得良好的预处理结构后，我们继续对12个经过筛选的载网使用Thermo Scientific Krios™ G4 Cryo-TEM进行无人值守EPU Multigrid数据收集(其中Krios™ G4配备了E-CFEG冷场电子枪、Thermo Scientific  Selectris™ X能量过滤器和Thermo Scientific Falcon 4直接电子检测相机)。我们将EPU Multigrid设置为每个载网收集1,000张图像，实现了每小时250张图像的速度。数据采集参数请见表1。
 

表1.冷冻电镜数据收集参数
 

　　使用4块GPU的工作站进行数据处理，每个数据集处理耗时约12小时，计算结构显示12个spike-Fab复合物的分辨率都优于3 Å(见表2)。
 

表2. 不同spike-Fab复合物的整体和局部分辨率。
 

　　使用cryoSPARC软件对Krios G4 Cryo-TEM收集的数据进行3埃内的结构重建。在漂移校正和CTF校正后，使用blob picker挑选颗粒，4x binning提取颗粒，并进行二维分类。本研究中的Fabs来自临床前开发阶段的抗体，其特征在于SARS-CoV-2和变异假病毒的中和等特征。在此，我们突出显示了来自12个Spike-RBD中S2和RBD的密度，以代表整体分辨率和局部分辨率(图3)。
 

　　图3. 本研究中的12个spike-Fab复合物的S2和RBD的代表性密度。S2通常是刺突蛋白中分辨率最高的部分。因此，S2的密度代表了整体分辨率。相反，RBD-Fab区域是多变的，通常分辨率很低。在这项研究中。对RBD-Fab区域进行了local refinement，以提高表位的局部分辨率。因此，RBD密度代表了与表位相邻区域的局部分辨率。
 

　　冷冻电镜更快速的数据收集与EPU Multgrid功能的实现，促进了基于片段的药物发现和抗原抗体结合表位的高通量筛选[4]。
 

　　References
 

　　1. C. O. Barnes et al., SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies, Nature, vol. 588, no. 7839, pp. 682–687, Dec. 2020.
 

　　2. J. Hansen et al., Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail, Science (New York, N.Y.), vol. 369, no. 6506, pp. 1010–1014, Aug. 2020.
 

　　3. A. Punjani, J. L. Rubinstein, D. J. Fleet, and M. A. Brubaker, cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination, Nature Methods, vol. 14, no. 3,
 

　　pp. 290–296, 2017.
 

　　4. M. Saur et al., “Fragment-based drug discovery using cryo-EM,” Drug Discovery Today, vol. 25, no. 3, pp. 485–490, 2020.