奥林巴斯相差显微镜校准

20世纪30年代仍然在寻找一种方法，利用所有方位角的直接光线和衍射光线产生不吸收光线的未染色物体的良好对比度图像。在此期间，Frits Zernike的研究揭示了零阶和偏离光之间的相差和振幅差异，这些差异可以被改变，从而为干涉和对比度增强创造有利的条件。

不吸收光的未染色标本被称为相位对象，因为它们稍微改变了被试样衍射的光的相位，通常通过延迟这种光约1/4波长，而未受影响的直接光通过或围绕未受影响的样本周围。不幸的是，我们的眼睛以及相机胶片都无法检测到这些相位差异。重申一下，人眼只对可见光谱的颜色（光频的变化）或不同的光强度（波幅的变化）敏感。

在载物台标本，直接零阶光通过或绕过非偏离标本。然而，被试样衍射的光不像吸光物体那样振幅减小，而是由于试样的折射率或厚度（或两者）而被试样放慢。此衍射光，通过约1/4波长滞后，到达图像平面失步（也称为异相）与非偏离光，但在干扰，基本上强度不减。其结果是目镜层面的图像如此缺乏对比，使细节几乎看不见。

Zernike成功地设计了一种方法 - 现在称为相差显微镜（Phase Contrast Microscopy） - 用于使未染色的相位物体产生对比度图像，就好像它们是幅度对象一样。当衍射光和直射光失步（显示相位差）1/2波长时，振幅物体显示出*的对比度。Zernike的方法是加速 1/4波长的直射光，使相位试样的直射光和偏向光之间的波长差现在是1/2波长。结果，到达目镜像高的直射光和衍射光将能够产生相消干涉（参见图像形成部分用于吸收先前描述的物体）。这样的过程导致图像的细节在较亮的背景下显得较暗。这被称为暗或正相差。图1中示出了基本相差显微镜配置的示意图。

另一种可能的过程中，常常要少得多使用的，是安排来减缓由1/4波长的直接光，使得衍射光与直射光到达在步骤目镜，并且可以干扰建设性。这种安排导致在较暗背景下的样本细节的明亮图像，并被称为负面或明亮的对比度。

相差显微镜非常成功，终得到了广泛的应用，导致Zernike在1953年获得了诺贝尔物理学奖。相差技术被誉为是一个世纪以来显微技术的大进步。相差，通过将诸如活体材料等相位标本“转换"成振幅样本，科学家们可以以未曾获得的清晰度和分辨率在未染色和/或活体中看到细节。

Zernike方法涉及在物镜的后焦面处从衍射光中分离直接零阶光。为此，将环形环置于聚光镜的前焦平面处的聚光器的下透镜的正下方，与物镜后焦平面共轭。由于来自环带的空心圆锥光束穿过样品，它以光环的形式到达物镜的后焦平面。由样本衍射的较暗的光线散布在物镜的整个后焦平面上。

如果这种组合被允许进入目镜的像平面，则衍射光将在直射光之后约1/4波长。在像面处，衍射光的相位与直射光相位相反，但其干涉的幅度几乎与直射光的相同。这将导致很少的标本对比。

为了加速直接零交叉的零阶光线，在物镜的后焦平面上安装一个相位板，并在其上安装一个环形移相器。相板的狭窄区域比板的其余部分光学上薄。结果，通过相位环的未经过的光在穿过物镜的玻璃上行进的距离比衍射光的距离短。

现在，当直下束光和衍射光前进到像平面时，它们彼此相位相差1/2波长。衍射光和直射光现在可以破坏性地干涉，使得样品的细节在较浅的背景下显得较暗（就像它们对吸收或振幅样品所做的那样）。这是对正相或黑相对比度发生的描述。

如果相位板的环形移相器区域要比其余的板更厚，则直接的光减慢1/4波长。在这种情况下，零阶光线与衍射光在步骤（或同相）到达像平面，并发生相长干涉。图像在较暗的背景下会显得很亮。图像在较暗的背景上显示为明亮。这种类型的相衬被描述为负面或明亮的对比度。

由于零级的零级光比微弱的衍射光要亮得多，所以在环上沉积一层薄的吸收性透明金属层，使直射光和衍射光的强度达到更好的平衡，以增加对比度。而且，因为在绿光的1/4波长上计算直接光的加速或减速，所以当光路中放置绿色滤波器（绿色干涉滤波器是优选的）时，相位图像将显得。这样的绿色滤光片还可以帮助消色差物镜产生良好的图像，因为消色差透镜是球面校正的。

相差工作所需的附件是一个配有环形和一组相位差物镜的分相式对比度聚光镜，每个相位对比物都安装了一个相位板。聚光镜通常有一个带有孔径光阑和环形空间的旋转转台的明场位置（不同放大倍数的每个相位物镜都需要随着物镜放大倍数的增加而增加直径的环形空间）。每个阶段的物镜都在其后部镜头上有一个黑圈。这样的物镜也可以用于普通的明场透射光工作，只是图像质量略有下降板

由制造商提供的相位装备通常包括一个绿色滤波器和一个相位望远镜。后者是用来使显微镜下车聚光镜环到叠加它到相板上的环。在分镜面聚光器中的一组定心螺钉允许操作环状物以使其对准，同时用相位望远镜（或通过伯特兰透镜）观察物镜的后焦平面。

为了建立一个相位显微镜（颊内衬细胞是一个容易获得的测试材料），集中标本与10X相差物镜。接下来，使用聚光镜的明场（0）位置将显微镜配置为科勒照明。这个关键的步骤是确保显微镜的物镜，聚光镜和视场光阑的正确对准。显微镜正确对准后，打开聚光器孔径光阑，并将聚光镜的转台旋转到10位置（通常会自动打开孔径光阑）。将绿色滤镜放在光路中，然后取下其中一个目镜。插入相位望远镜，观察物镜的背面，使用环形定心螺钉将环状体对准板的环。如果有Bertrand镜头或针孔目镜，则可以查看物镜的后焦面。如果试样暂时从光路上移开，则相位环的中心往往更容易做到。将相位环与环状物对齐后，重新插入目镜并将样品放回到光路中显微镜台上的适当位置。

对每个物镜重复相同的步骤，确保转台旋转，使适当的相位环与物镜放大倍率相匹配。一些制造商提供可插入普通阿贝聚光镜下部的单独推入，对中和环形。这种便宜，简单的设备在10X，20X和40X相位物镜上效果很好，但是聚光镜一次只能接收一个。

相显微镜仍然是一个广泛使用和重要的工具，特别是对显微镜学家研究活体和/或未染色的材料，例如培养中的细胞和组织。该方法目前还与反射光荧光同时使用，以显示不发荧光的样本的区域。相位显微镜技术对于在视场中很薄且分散的样本特别有用。

相差显微镜有一些局限性：

• 相位图像通常围绕着细节轮廓周围的光环。这种光晕是光学伪影，有时会遮掩细节的边界。

• 相位的环不限制的光学系统的工作数值孔径到一定程度，从而降低了分辨率。

• 相位对比不适用于厚的样本，因为相位偏移发生在略低于或略高于焦点平面的区域。这种相位偏移混淆了图像并扭曲了图像细节。

• 如果使用白光，相位图像显示为灰色，如果使用绿色滤光片，相位图像显示绿色。过去，许多显微镜专家在进行相显微摄影术时将其电影限制为黑白。今天，许多彩色电影非常有效地再现黑色，白色和灰度，特别是富士，柯达和爱克发的钨平衡透明胶片。

相差显微镜是另一个例子，说明在镜下液位聚光镜和物镜后焦平面上光线的操纵如何对通过目镜观察到的图像产生显着影响。