奥林巴斯显微镜光学元件介绍

现代复式显微镜的设计提供了一个放大的二维图像，可以在连续的焦平面上进行轴向聚焦，从而能够在二维和三维上对样本的精细结构细节进行*检查。

大多数显微镜提供附着在载物台上的平移机制，允许显微镜专家精确定位，定向和聚焦样本，以优化图像的可视化和记录。整个显微镜的光路的照明强度和方向可以通过有策略地放置的光阑，反射镜，棱镜，分光镜和其他光学元件来控制，以达到样品中所需的亮度和对比度。

图1中显示的是一个典型的显微镜配备三目头和35毫米相机系统记录显微照片。照明由位于灯箱内的卤钨灯提供，该灯发出的光首先通过收集器透镜，然后进入显微镜基座中的光路。驻扎在显微镜基座上的是一系列过滤器，在白炽灯被镜面反射并通过视场光阑并进入下一级聚光镜之前，该过滤器对白炽灯发出的光进行调节。聚光镜形成一个锥形的照明，使位于显微镜台上的样品沐浴，然后进入物镜。离开物镜的光被分束器/棱镜组合转向到目镜以形成虚像，

现代显微镜中包含的光学元件安装在一个稳定的，符合人体工程学设计的基座上，可以实现快速交换，精确对中以及在光学上相互依赖的那些组件之间的精确对准。在一起，显微镜的光学和机械部件，包括在玻璃微型幻灯片和盖玻片上安装的标本，形成一个光学列车具有穿过显微镜基座和支架的中心轴。显微镜光学系统通常由照明器（包括光源和收集器透镜），下一级聚光器，标本，物镜，目镜和检测器组成，这是相机或观察者的眼睛（表1）。研究级显微镜还包含经常位于照明器和聚光器之间的几个光调节装置中的一个，以及插入物镜与目镜或相机之间的互补探测器或过滤装置。调节装置和检测器一起工作以根据样本和照明技术的空间频率，相位，偏振，吸收，荧光，离轴照射和/或其它特性来改变图像对比度。

显微镜光学组件

表格1

虽然一些显微镜光学元件用作图像形成元件，但是其他元件用于对样品照射进行各种修改，并且还具有滤波或变换功能。涉及由显微镜光学组件形成图像的组件是收集器透镜（位于照明器内或附近），聚光镜，物镜，目镜（或眼睛）以及人眼或相机镜头的折射元件。尽管这些组件中的一些通常不被认为是成像组件，但是它们的成像性质对于确定显微镜图像的终质量是极为重要的。

在显微镜中理解图像形成的基本原理是构成光学组件中各组件的各个透镜元件的作用。的成像元件是一个完美的镜头（图2），这是一个理想的校正玻璃元件，没有像差，并将光线聚焦在一个点上。平行的旁轴光束通过会聚透镜，并通过折射聚焦到位于透镜焦点（图2中标记为Focus的点）的点光源。这样的镜头通常被称为正面因为它们会引起会聚光束更快地会聚，或者使发散光束发散得更慢。位于透镜焦点处的点光源在离开透镜时从近轴平行光束出射，在图2中从右向左移动。透镜和焦点之间的距离被称为焦点透镜的长度（由图2中的距离f表示）。

光学现象通常用量子理论或波动力学来解释，这取决于所描述的具体问题。在考虑透镜的作用时，波状特性往往可以忽略不计，光线被认为是以直线行进，通常称为光线。简单的射线图足以解释显微镜的许多重要方面，包括折射，焦距，放大率，成像和隔膜。在其他情况下，将光波称为离散粒子（量子）是方便的），特别是当量子力学事件产生光或转化为其他形式的能量时。这个讨论将被限制于利用符合光的波状性质的近轴光线的光学透镜模型以及光从左向右传播的简单光线图。近轴光线是非常接近光轴的光线，导致非常小的入射角和折射角，当以弧度测量时，可以认为是等于它们的正弦值。

在光的平行光束，从个人单色光波形成波列具有电场和磁场矢量在相位振动而形成的组合波阵面，其具有垂直于波的传播方向的振动方向。平面波在通过完美透镜时转换为球面波，正面以焦点为中心（Focus）的镜头（图2）。光波到达焦点，并在这个位置相互建设性干涉。或者，包括从理想透镜的焦点发出的球面波前的光被透镜转换成平面波（在图2中从右向左）。平面波中的每个光线在遇到透镜时经历不同的方向改变，因为它以稍微不同的入射角到达表面。从镜头出射时，光线的方向也改变。在实际系统中，透镜或透镜组的折射角和焦点取决于系统中每个元件的厚度，几何形状，折射率和色散。

完美透镜（或透镜系统）的一般作用是将一个球面波转换成另一个球面波，透镜的几何特性决定了焦点的位置。随着光源距离透镜的距离增加，进入透镜的发散光线的角度随着波前半径的相应增加而减小。如果进入透镜的球面波的半径是无限的，则通过透镜的球面波的半径等于透镜的焦距。一个完美的镜头有两个焦点，通过镜头的平面波聚焦到这些点之一，取决于光线是从镜头的左侧还是右侧进入。

在平面波的传播方向与透镜的光轴不一致的情况下，由透镜产生的球面波的焦点也从轴上移除。图3说明了平面波前以角度（α）倾斜时遇到完美透镜的情况。产生的球形波的中心被标记为S，并且位于距轴向焦点（在图3中标记为焦点）的距离δ处，但在同一焦平面内。δ的值可以表示为：

其中f是完美透镜的焦距。就几何光学而言，f是指以S为中心并通过透镜中心的弧的半径，就好像它是单个折射面。

另一种用于研究不在透镜焦平面上的光（S（1））的模型如图4所示。在该图中，将完美透镜分解成两个单独的透镜元件（透镜（a）和透镜（b）），使得光源S（1）的位置距离透镜（a）的距离等于f（a）（焦距）。类似地，光源S（2）位于距镜头（b）的焦距f（b）的距离处。连接透镜（a）和透镜（b）的中心的直线称为镜头系统的光轴。

在双透镜系统（图4）中，从光源点S（1）发出并位于离透镜光轴距离δ处的球面波阵面被透镜（a）转换成平面波。当从透镜（a）出射时，平面波相对于透镜轴倾斜角度α。δ和α通过上面讨论的正弦方程相关，其中f的值被f（a）代替。在通过第二透镜（透镜（b））之后，平面波被转换回具有位于S（2）的中心的球面波，。结果是等于透镜（a）+ 透镜（b）的完美透镜L将来自点S（1）的光聚焦到点S（2）上，并且通过聚焦来自点S（2）的光来执行相反的动作。到点S（1）。在透镜系统中具有这种关系的焦点通常被称为共轭点。

在经典光学术语中，光源S（1）与透镜的入射面之间的空间被称为物体空间，而第二透镜出射面与点S（2）之间的区域被称为在图像空间。涉及主光线或次光线的所有点被称为物体（或光学显微镜中的样本），而包含由镜片折射而集中的光线的区域被称为图像。如果光波相交，则图像是真实的，而如果只有折射光线的投影延伸相交，则虚像图像由透镜系统形成。当投射到屏幕上时，真实图像可以被可视化，在照相胶片乳剂上捕获，或者通过电荷耦合器件（CCD）的光电二极管元件组织成数字阵列。相反，虚像需要另一个镜头或镜头系统的帮助才能被观察者看到。

如果将图4中的点S（1）展开为在同一焦平面上散布的一系列点，则完美透镜将把该系列中的每个点聚焦到S（2）焦平面上的共轭点上。在S（1）的点集合位于与透镜的光轴垂直的平面中的情况下，集合S（2）中的对应共轭点也将位于垂直于该轴的平面中。反过来也是如此：透镜将把S（2）中的每一点都聚焦到点集S（1）的平面或曲面上的共轭点上。这种类型的相应的平面或表面被称为共轭平面。

图5中示出了用于表示一列传播光波的替代方法，用于倾斜的光波。该方法依赖于应用几何光学法则来确定由透镜或多透镜系统形成的图像的尺寸和位置。两个代表性的光线，一个近轴，一个穿过镜头中心（主光线），这些都是确定成像情况的参数所必需的。高斯光学的许多教科书都将这些光线称为特征光线主光线是穿过入口和出口瞳孔的中心，透镜以及光学系统中存在的任何孔径光阑的光线。通常，忽略主光线，利用通过透镜的前后焦点的特征光线来确定物体和图像的大小和位置。在图5中，第二特征射线被示为穿过透镜的前焦点（F'）的黄色填充的虚线。

标本或光源在图5中被标记为S（1），并位于被称为物体空间的区域中距离透镜左侧的距离a处。由从S（1）发出的虚线表示的与物体侧焦点（F'）处的光轴相交的单个光线被透镜的两个表面折射并平行于光轴出射。的折射和入射光线的延伸部在表面相交位于距离透镜内一个从源（S（1））。该表面被称为或物体侧主表面，并由P（1）在图5中，从S（1）沿平行于光轴的方向前进的上面的光线被透镜折射并穿过像侧焦点（F）。折射和入射光线的延伸线在透镜内在图像侧主表面（在图5中标记为P（2））相交并且位于距图像点S（2）的距离b处。在透镜轴附近，表面P（1）和P（2）接近平面并且被称为主平面的镜头。这些平面与透镜的光轴（未示出）的交点被称为主点。呈现左右对称的简单凸透镜具有与透镜表面对称的主点。更复杂的透镜和多透镜系统通常具有与透镜表面一致的主点，或者甚至延伸到玻璃元件的外部。

用于定义透镜参数的另一组点是节点，其出现在通过透镜的倾斜光线的延伸与光轴相交的地方。图5中没有示出节点，但是将非常接近镜头的主要点。因此，三对点，即透镜焦点（F和F'），主平面（P（1）和P（2）），主节点全部位于镜头光轴上。如果已知焦点的位置以及主点或节点，则可以在不考虑镜片的每个表面处的光线的折射的情况下进行光线迹线的几何构造以阐明物体和图像参数。其结果是任何透镜系统都可以仅利用焦点和主平面通过描绘光线轨迹来仿真，就好像它们遇到主平面一样，平行于光轴行进，并且从第二主平面出射而没有折射。

注意，距离a大于图5中的镜头前焦距f'。在这些情况下，然后在镜头空间的右侧距离b处的图像空间中形成倒像（S（2））。b的长度大于透镜后焦距f，其与经典透镜方程的距离a和b有关：

图像S（2）的高度由数量h（2）表示，并且表示由位于镜头前部的物体或样本S（1）的放大率导致的尺寸增加，其高度为h（1）。这个简单透镜（近似于高斯薄透镜）的横向放大倍数M由下式表示：

因为S（1）和S（2）位于聚焦平面内，所以图像S（2）将由透镜在S（1）处聚焦。那么焦距将由f'表示，并且当考虑到相反的情况时，由于图像尺寸的减小，倍率（M）被翻转为1/M。

在透镜的物侧沿光轴的两个像点与在像侧的两个共轭点之间的距离比被称为纵向或轴向放大率。纵向放大倍数的大小是距图像平面小距离的横向放大率的平方。

光学显微镜中的所有成像部件都由上述的基本几何关系控制。这包括收集镜头，聚光镜，物镜，目镜（投影模式），相机系统和人眼。

显微镜光学组件的阶段是灯箱，它包含灯和聚光镜，负责建立显微镜的主要照明条件。图6中示出了典型的灯和收集器透镜配置的示意图。图像大小和位置根据图5中介绍的基本主透镜系统的约定来呈现。卤钨灯发射的光线通过聚光透镜系统，灯丝聚焦在聚光镜的前焦面上。显微镜光学组件（图像平面（1））中的个图像平面出现在视场光阑的位置。

当显微镜被配置为在科勒照明条件下操作时，灯丝上的点S（1）与点S（2）聚焦，该点S（2）在聚光器孔径光阑的焦平面中成像。从S（1）到收集器透镜系统的主平面的距离由距离a表示，并且从聚光器虹膜光阑到收集器的图像侧主平面的距离由距离b给出。显微镜视场光阑（图6和图7）控制照明系统在进入聚光器孔径之前发射的光束的直径。

图7示出了聚光透镜中的聚焦平面与照明系统之间的关系。当显微镜是（例如）显微镜时，场光阑（图像平面（1））成像在与样本（图像平面（2）配置科勒照明。聚光镜（F'）的前焦面位于孔径光阑的中心。长度a和b分别表示视场光阑（图像平面（1））和样本平面（图像平面（2））与聚光透镜元件的主平面之间的距离。由灯箱发出并穿过聚光镜的光被形成为一个照明锥体，其沐浴并随后穿过样本。调节聚光镜光圈光阑的开口尺寸，控制该照明锥的数值孔径。

图8给出了物镜的图像平面，图8给出了典型的客观内部透镜系统，样品平面（图像平面（2））和显微镜中间图像（图像平面（3））的相对位置。试样平面与中间像平面共轭，并且分别与物镜主平面分开距离a和b。物镜前焦点标记为F'，而物镜后焦点平面内出现的后焦点标记为F。内部透镜元件通常是由半球形和弯月形透镜，透镜双合透镜和三合透镜以及不同设计的单透镜元件组成的复杂组件。

目镜（或目镜）被设计为投影实像或虚像，这取决于中间像平面，目镜焦平面和内部目镜场光阑之间的复杂关系。此外，固定目镜光阑的直径也决定了显微镜观察者观察到的线性视场尺寸。这个值被称为场数或视场数（缩写为FN），通常刻在目镜外壳的外部。

当使用投影模式时，目镜的图像平面如图9所示。主要焦点分别是F'和F，前后焦点。中间图像平面（图像平面（3））位于固定目镜视场光阑的中心，根据设计，它位于目镜视场镜头之前或之后。该图像平面与图像平面（4）共轭，并且是目镜聚焦和测量分划板被插入的位置。长度a表示从目镜固定光圈到眼镜主平面（靠近观察者眼睛的镜片）的距离，而b是位于传感器表面上的从眼镜到图像平面（4）的距离。因为a大于眼镜（f'）的前焦距，所以在图像平面（4）处形成的图像是真实（非虚拟）图像。数量f表示从眼镜到目镜后焦平面（F）的距离，也表示目镜系统的后焦距。

视频和CCD传感器上的图像平面如图10所示，该图显示了将特殊的正投影透镜应用于这些传感器的成像。焦点（F）位于视频管阴极或CCD光电二极管阵列表面，取决于探测器的几何形状和其他参数。如果投影透镜位于光学系统中的目镜之后，则它将虚像（位于图像平面（3'））会聚到图像平面（4）处的传感器表面上。这个图像平面位于距离b从投影eyelens，这是等于透镜的焦距。应该注意的是，也可以使用传统的胶片照相机系统代替视频或CCD传感器，在这种情况下，图像平面与层叠在胶片基底上的化学乳剂的平面重合。

当图像在显微镜进行检查，一个中间图像（参照图像平面（3）在图11中）被物镜一定距离形成一个，这比其前焦距（稍微靠近目镜F"）。这防止了在目镜之后形成真实图像，如图9中针对在投影模式下操作的目镜所示。眼睛和目镜一起在视网膜（图像平面（4））上形成一个图像，就好像眼睛看到了虚像。

在距离a小于焦距的情况下，将焦距与a和b相关的倒数方程显示b必须小于零。因此，在没有眼睛或相机的情况下，在目镜的右侧不会形成真实图像。取而代之的是，虚拟图像（图像平面（3'））出现在与目镜左侧（或右侧的b，参见图5）相对应的-b（图11）的距离处。当通过目镜观察图像时，通过眼镜发出的成像光束似乎源于虚拟源（位于图像平面（3'）））。离开目镜的光线形成构成显微镜出瞳的照明锥，该显微镜通常也被称为眼点或拉姆斯登光盘。为了正确观察放大的标本，显微镜出瞳必须与观察者眼睛的瞳孔重合。

如图12所示，图像平面2,3,3'和4（图7-11）在几何上彼此相关。在所有成像步骤中，除图像平面（3'）外，图像是真实的和倒置的（见图7-11）。当显微镜目镜用于直接观察（图11）而不是用于投影（图9）时，图像平面（3'）处的图像不是真实的，而是虚拟的，并且相对于中间图像不是反转的。人眼将不会感觉到视网膜上的图像（图像平面（4）），为反转，即使图像是相对于倒到中间图像（图像平面（3））和虚拟图像（位于图像平面（ 3'））。

显微镜中的几个主要图像平面出现在固定或可调光圈或光阑中，这是所有光学系统的重要组成部分。光圈，也称为光圈，是一个不透明的门或带有圆形开口（通常是可调节的）的透镜支架，用于控制通过显微镜的光线。在显微镜中使用两种基本类型的隔膜：调节显微镜中孔径角度的孔径光阑和视场光阑它控制着仪器成像的场的大小。光阑在光学显微镜中的主要作用是防止具有严重像差的光线和杂散光到达成像平面，并确保物体和图像空间中光的合适分布和强度。

经典的显微镜设计依靠两个孔径和两个光阑来控制光线通过显微镜。位于灯箱内或显微镜底部的视场光阑是一个可调节的虹膜型光阑，用于确定照明场的大小。位于聚光镜前焦平面的是聚光器光圈，另一个光圈用来调节照射到样品上的光束的大小和角度。第三个孔径具有固定的尺寸，位于物镜的后焦平面上。该孔径决定了目标出射光瞳的直径和中间图像的大小，而目镜（目镜视场光阑）中的共轭固定光阑决定了显微镜人员所看到的视场的大小。

显微镜的总放大倍数可以通过考虑物镜和目镜的性能来确定。目标是针对特定的投影距离进行校正的，该投影距离特定于放大倍数并且近似等于光学管长度。在固定的管长显微镜中，这个投影距离约为160毫米。因此，8毫米焦距物镜的横向放大倍数约为20倍（160/8），纵向放大倍数为400倍（20×20）。

对于目视观察，当样本（或图像）被放置在离观察者眼睛250毫米的距离处时，目镜放大率被假设为一致。就这一点而言，焦距为25毫米的目镜将具有10倍（250/25）的放大率值。目视观察的总显微镜放大率是通过取目标和目镜放大倍数的乘积来计算的。对于刚描述的目标和目镜，总的横向放大倍数将是大约200倍（10倍目镜乘以20倍物镜）。应该注意的是，大多数现代研究显微镜都配备有无限校正的物镜，不再将中间图像直接投射到中间图像平面中。从这些目标出现的光线反而集中在无限远处，管镜头，在其焦平面形成图像。离开无限远聚焦物镜的光线是准直的，允许将辅助元件（如差分干涉对比（DIC）棱镜，偏振器和落射荧光照明器）引入物镜与管镜之间的平行光路对聚焦和像差校正的影响小。

无限远校正的光学显微镜系统的中间图像的放大率由管透镜和物镜的焦距的比率确定。由于管透镜的焦距在160和250毫米之间变化（取决于制造商和型号），物镜的焦距不能再假设为160毫米除以其放大倍率。因此，在具有200毫米管透镜焦距的无限远正确显微镜中，具有8毫米焦距的物镜将具有25x（200/8）的横向放大率。

较老的有限的或固定的管长度的显微镜与物镜筒固定的物镜转换器开口之间有一定的距离，与目镜管的目镜座相距一定距离。这个距离被称为显微镜的机械管长度。该设计假定当样品放置在焦点上时，它比物镜的前焦平面稍微远离几微米。显微学会（RMS）在十九世纪将有限的管长度标准化为160毫米，并在100多年中得到广泛接受。设计用于具有160毫米管长的显微镜的物镜与该值一起刻在圆筒上。

将光学附件添加到固定管长度显微镜的光路中，将有效管长度增加到大于160毫米的值。由于这个原因，添加垂直反射光照明器，偏振中间级或类似的附件可以将球面像差引入另外完美校正的光学系统。在大多数显微镜具有固定管长度的时期，制造商被迫将额外的光学元件放入这些附件中以重新建立显微镜系统的有效的160毫米管长度。这一行动的成本往往是增加放大倍数，并降低所得图像的光强度。

对于使用视频显微镜，光电二极管阵列CCD相机或带有胶片相机的经典显微摄影记录图像，通常在目镜之后放置专门的正透镜（见图10）。从目镜聚焦到无限远处的光线被正透镜会聚到光阴极，CCD阵列或照相乳剂的平面上。当物镜的放大率被忽略时，投影系统的横向放大率（M（p））表示为：

其中f（p）是投影透镜的焦距，f（e）是目镜焦距。在这个投影系统中，摄像机面板，CCD光电二极管阵列或照相乳剂的总横向放大倍数（M）为：

其中M（o）是物镜放大率，M（e）是目镜的放大率。如果在目镜之后不使用投影透镜，而是使用目镜本身将图像投影到视频图像传感器或照相乳剂上，则总横向倍率变为：

其中D（p）是从目镜到像面的投影距离。为了避免图像失真，D（p）应该使用至少20到30厘米的数值，除非使用特殊的目镜。

制造商在物镜镜筒或目镜镜片上刻出的放大倍数是标称的，必须用台式千分尺进行校准以获得准确的数值。放大倍数的测量是通过将台式千分尺放置在试样平面上（在显微镜台上）并在相同的光学条件下对细线进行成像来完成的。

在某些情况下，照相机传感器直接放置在中间图像平面上，不存在投影目镜，导致图像放大倍数受到物镜产生的影响。只有当视频系统的性能受可用光的数量限制时，才建议使用此方法，因为这种固定的放大倍数对优化终视频图像质量的能力施加了严重的限制。

总之，通过有限长度管和无限远校正显微镜的射线路径在图12和图13中被讨论和示出。图12中示出了有限的（固定管长度）显微镜光学组件，其包括基本的光学元件和射线轨迹定义图像平面之间的关系。在物镜前焦平面通过共轭平面成像到位于图像平面（4）的眼睛的视网膜上之前的一小段距离处的样本。物镜将放大的样品的真实和倒置图像投影到显微镜的中间图像平面（图像平面（3）），它位于物镜后方固定距离的目镜视场光阑中心。在图12中，物镜后焦平面位于标记为F'（物镜）的光轴上的位置，该焦平面与中间像平面之间的距离表示显微镜的光学管长度。

空中影像被显微镜目镜进一步放大，并在视网膜表面产生一个直立的图像，这与试验显微镜相反。如上所述，通过考虑样本与物镜之间的距离以及物镜系统的前焦距（F（物镜））来计算样本的放大倍数。在中间平面产生的图像进一步放大了25厘米（称为眼睛的近距离）除以目镜的焦距的因数。视觉图像（虚拟）出现在观察者身上，就好像它距离眼睛10英寸。

大多数目标被校正以在窄范围的图像距离内工作，并且许多目标被设计成仅在具有匹配目镜的专门校正的光学系统中工作。物镜筒上的放大倍数是针对设计物镜的显微镜的管长确定的。

图13所示的是使用射线追踪的无限远校正显微镜系统的光学系统。为了便于比较，该系统的组件以类似于有限管长度系统（图12）的方式进行标记。这里，物镜的放大倍数由管透镜的焦距决定。请注意物镜和镜筒之间每个方位上的平行光束所定义的无限远“无焦"空间。这是显微镜制造商用来添加垂直照明器，DIC棱镜，偏光片，延迟片等附件的空间，设计简单得多，图像畸变很小。无限远校正系统中物镜的放大倍数等于管透镜的焦距除以物镜的焦距。

在光学显微镜中，共轭平面彼此成像并且可以在目镜中检查样本的同时被共同观察。这个概念在图14中示出，其中植物组织的染色薄切片的图像叠加在视场光阑的虹膜叶上，并且在目镜中间图像平面中具有聚焦标线。与聚光灯透镜相邻的场光阑光阑通过显微镜聚光镜与样品锐利地成像在同一平面上。通过物镜在中间像平面上形成视场光阑和样本的图像，并将其投影到聚焦光栅所在的目镜的固定视场光阑中。随后，目镜（与位于图像平面（4）的观察者的眼睛一起））在成像系统的传感器表面或人眼的视网膜上形成所有三个之前的图像平面的图像。视场光阑，标本，中间图像和视网膜都构成一组同时出现在焦点上的共轭图像平面。