在荧光显微镜应用中经常采用各种机制，以将荧光团的激发和检测限制在样品的薄区域。消除焦平面外部的背景荧光可以显着提高信噪比，从而改善感兴趣的特征或事件的空间分辨率。全内反射荧光显微镜（TIRFM）利用了诱发e逝波或场的*特性在有限的样本区域中，该区域紧邻具有不同折射率的两种介质之间的界面。实际上，在TIRFM的应的接口是样本与玻璃盖玻片或组织培养容器之间的接触区域。

图1-全内反射荧光

TIRFM的基本概念并不是什么新鲜事物，并且由于促进了其使用的技术进步，近对该技术产生了很多兴趣和热情。使用该方法的完整现成仪器系统的可用性以及荧光团技术的发展，例如遗传编码的荧光物质，使得直接研究许多细胞膜和其他表面过程成为可能。

TIRFM的物理基础

全内反射（TIR）的物理现象在诸如现代光纤数据传输之类的看似多样化的应用中以及在钻石切割器用于增强切工宝石的火花或“火”的数百年历史中一直被依赖。在每种情况下，当光遇到折射率不同的两种介质之间的界面时，光的折射（或弯曲）（n）导致将部分或全部光线限制在折射率较高的介质上。传播通过一种介质并到达该界面的准直光束，在入射到第二种介质时会发生折射，或者在入射时在界面处反射，这取决于两种介质的入射角和折射率差。只有在传播的光遇到折射率较低的介质的边界的情况下，才可以进行全内反射。其屈光特性受斯涅尔定律控制：

n(1) × sinθ(1) = n(2) × sinθ(2)

其中n（1）是较高的折射率，n（2）是较低的折射率。入射光束相对于界面法线的角度由θ（1）表示，而低折射率介质内的折射光束角度由θ（2）给出。当光以足够高的角度（称为临界角（θ（c）））入射到两种材料的界面时，其折射方向变得与界面平行（相对于法线90度），并且在较大角度下被反射*回到媒介。

图2 -TIRFM样品照明配置

尽管当光以大于临界角的角度入射时，光不再进入第二介质，但反射的光在低折射率介质中会在界面附近产生高度受限的电磁场。该e逝场的频率与入射光相同，并且由于它的强度随距界面的距离呈指数衰减，因此该场在z方向的样品中延伸的距离多为几百纳米。方向（垂直于接口）。在典型的实验装置中，位于玻璃-液体或塑料-液体表面附近的荧光团可以由van逝场激发，只要它们在照明光束的波长带宽之内或附近具有能量时具有潜在的电子跃迁。由于e逝场强度呈指数下降，因此荧光团的激发被限制在厚度通常小于100纳米的区域。相比之下，该光学部分的厚度约为通过共聚焦荧光显微镜技术产生的厚度的十分之一。由于避免了在整个标本中激发荧光团，因此将次级荧光发射限制在非常薄的区域，与传统的宽场落射荧光照明相比，可获得更高的信噪比。这种增强的信号水平使得可以通过TIRFM方法检测单分子荧光。

全内反射荧光的基本概念如图1所示。，其中装有荧光分子的标本细胞（图中绿色荧光团）支撑在玻璃显微镜载玻片上。载玻片（1.518）和水性样品介质（约1.35）的折射率适合支撑载玻片内的全内反射。通过将激光激发入射角调整到大于临界角的值，在遇到界面时，照明光束会*反射回显微镜载玻片，并且在紧邻界面的样本介质中会产生an逝场。玻璃表面的荧光团通过与the逝场的相互作用而被选择性激发，并且可以通过显微镜光学器件收集来自这些发射体的二次荧光。

如先前所讨论的，在不同介质之间的界面处的折射或反射之后传播光束所成的角度取决于该界面处的光入射角以及两种材料的折射率。可以通过操纵上面给出的斯涅尔定律表达式来计算入射的临界角，超过该临界角就会发生全内反射。将方程式应用到细胞膜过程的典型生物学研究中，显微镜载玻片或盖玻片的折射率由n（1）（约1.5）表示，而n（2）代表水性缓冲溶液或细胞质的折射率组件（1.33至1.38）。用N（1）大于N（2）当θ（1）超过临界角θ（c）时，玻璃内部会发生全内反射。在临界入射角处，折射发生在90度（sinθ（2）= 1），斯涅尔定律简化为：

n(1) × sinθ(c) = n(2)

或

sinθ(c) = n(2)/n(1)

因此，临界角可以表示为：

θ(c) = sin-1n(2)/n(1)

全内反射不会在临界角处突然出现，作为一种新现象出现，但是会发生连续的过渡，从具有少量反射的主要折射到超过临界角时的全反射。随着入射角朝向临界角值增加，透射（折射）光束的强度会降低，而反射光束会变得更强。在大于临界角的所有角度处，实现了全内反射，其中，基本上所有的光都反射回到介质中。即使光不再传播到第二种介质中，反射光也会穿过界面少量穿透，然后平行于表面传播，在紧邻界面的第二种介质中产生电磁场。该场称为瞬逝场，并且在界面附近的有限区域内，它能够激发荧光团。可能的激发范围受到van逝波能量在z方向（垂直于界面）的指数衰减的限制。以下等式将该能量定义为距界面的距离的函数：

E(z) = E(0)exp(-z/d)

其中E（z）是距界面垂直距离z的能量，E（0）是界面处的能量。穿透深度（d）取决于入射照明的波长（λ（i）），入射角以及界面处介质的折射率，根据以下公式：

d = λ(i)/4π × (n(1)²sin²θ(1) - n(2)2)^-1/2

在小的入射角处，通过界面传播到低折射率介质的光波是正弦波，并具有特征周期。随着角度的增加，接近临界值，折射光的周期变得更长，传播方向变得更加接近界面。当达到临界角时，波周期变为无限，并且折射的光波阵面垂直于界面对齐。

图3-高数值孔径物镜TIRFM

总之，在显微镜检查中，有几个关键因素决定着van逝波的利用。为了发生全内反射并产生渐逝场，照明入射介质的折射率必须大于样本介质的折射率（n（1）大于n（2）），并且入射角必须为（θ） （1））必须大于临界角（θ（c））。入射照明波长会影响the逝波的穿透深度和被激发的特定荧光团，这两个荧光团必须在光源的波段内具有适当的吸收特性。波长效应的影响与the逝波的能量在z中呈指数下降的事实相结合方向是可以在非常薄的光学部分（通常厚度小于100纳米）中诱导高特异性荧光激发。尽管TIRFM仅限于在两种具有合适折射率的不同介质的界面上成像，但大量应用却非常适合该技术。研究兴趣的领域之一是生物医学领域，其中许多令人信服的问题涉及在细胞表面或质膜上发生的过程-TIRFM研究的适当接口。

TIRFM的基本工具方法

有在配置于全内反射荧光显微镜的仪器两种基本的方法：该棱镜方法，和物镜方法。图2说明了这两种一般配置。在棱镜技术中，聚焦激光束通过附着在显微镜盖玻片表面的棱镜被引入显微镜盖玻片，并且光束入射角被调整为临界角（见图2（a）））。依赖于棱镜来引入照明光束有几个局限性，主要是由于样品处理的几何约束，尽管该方法已在生物学应用中使用了二十多年，但它从未成为主流研究工具。棱镜的配置有很多变化，但大多数限制了对标本的访问，从而难以进行操作，将介质注入标本空间或进行生理测量。

棱镜技术的另一个缺点是，在大多数基于倒置显微镜设计的配置中，例如Nikon Eclipse Ti2，照明是在与物镜相对的标本侧引入的，需要对整个标本的van逝场区域进行成像。为避免这种情况，将棱镜放置在样品的物镜侧会带来其他问题，因为短距离工作物镜与样品和棱镜的位置非常接近。在配置显微镜系统以利用全内反射时所需的一般复杂性和精度使许多潜在的研究人员望而却步，直到显微镜制造商可以使用完整的（“交钥匙”）系统为止。想要利用这项技术的研究人员需要设计和构建自己的系统，而这一困难，加上在光学平台上设置和维护开放式激光器的必要性，

图4 -TIR和广域荧光中的微球

物镜技术有时称为透镜照明，它避免了利用棱镜以所需角度引入光的许多限制（请参见图2（b））。）。在该方法中，使用物镜将相干激光或非相干弧光灯照明引入盖玻片-标本界面。通过使用高数值孔径（理想地为1.45或更高）的物镜，可以实现大于临界角的入射角。通常，物镜的数值孔径被认为是表征透镜的聚光能力的特征。相反，数值孔径直接确定当光用于传递照明时可以离开物镜的角度范围。数值孔径与可达到的照明入射角之间的关系由以下方程式描述：

数值孔径(NA) = n × sin(θ)

其中NA是物镜的数值孔径，n表示折射率，θ是物镜物镜孔径的一半。将该关系与上面给出的用于全内反射的条件结合起来可以说明，典型折射率为1.38的活细胞需要以数值孔径大于1.38的物镜进行照明才能实现全内反射。进入物镜的光必须穿过孔径锥的对应于大于1.38的数值孔径值的部分，以便在样品-玻璃界面处被*反射。如果采用相干激光照明，则必须将其聚焦在物镜后孔径的周围，以确保光以等于或大于临界值的角度离开前光学表面。如果是非相干照明，例如来自弧光放电灯的照明，

通过将物镜的后焦平面处的照明限制在一个圆形的环形区域，通常会以亚临界角出射的来自照明锥中心的光线被阻挡。来自物镜的终发射是空心圆锥体，它以足以导致全内反射的半角入射到TIR界面上。如果大量的照明穿过物镜后孔径的*部分（较低的数字孔径区域），则会产生落射照明而不是全内反射，从而降低了像面上的信噪比。实际上，不透明的阻光盘可以安装在可移动的滑块上，从而有助于TIRF和落射照明成像模式之间的快速切换。

与基于棱镜的技术相比，通过使用高孔径物镜完成e逝场激发在标本处理和测量选项方面提供了更大的灵活性，但精确控制入射照明角度更加困难。当使用激光源时，耦合到棱镜的光的入射角很容易在很宽的范围内变化，从而可以直接控制control逝场的穿透深度。对于物镜系统，物镜后焦平面中的激光聚焦点是偏轴的（利用光圈的外部），并且距镜头轴的径向距离增加会相应地增加光入射到样品上（参见图3）。

如果物镜的数值孔径足够大，则可以实现全内反射的临界角。由于主要细胞成分（胞质溶胶）的折射率约为1.38，因此需要一个超过该数值的物镜数值孔径。使用1.4数值孔径的物镜，只能将透镜外围区域的百分之一用于全内反射，并且临界角只能略微超过，这使得将激光耦合到后孔径是一个非常困难的过程。显然，较高数值孔径的物镜是有利的，并且为超出临界角的角度的细调提供了额外的工作余量。一旦超过临界角，

TIRFM应用

通常，全内反射照明在需要成像的标本中的微小结构或单个分子具有位于感兴趣的光学平面之外的大量荧光团的任何应用中都有潜在的好处，例如溶液中处于布朗运动的分子，经历内吞作用的囊泡或胞吐或细胞中的单个蛋白质运输。由于限制了激发区的厚度，这种样品通常表现出信噪比的急剧增加。图4呈现了利用TIRFM方法（图4（b））和常规的落射荧光照明（图4（d））获得的荧光微球溶液的图像。每个图像的左侧是其相应的强度直方图（图4（a）和4（c））。在图像中以及与TIRFM图像相对应的直方图中，在明显的局部化和较高的信号强度下，通过将信噪比（S / N）从1.3增加到35所提供的球体分辨率得到了明显改善（图4（a））。

图5-宽视野和TIR荧光中的细胞焦点粘附

长期以来，人们已经认识到TIRFM可能会成为回答许多生物学问题的有力工具，尽管使用了20多年，但该技术直到近才引起人们的广泛关注。TIRFM在1980年代初期研究了用荧光脂质标记的人皮肤成纤维细胞的细胞-基质接触。大约在同一时间进行的另一项研究结合了TIRFM和荧光光漂白恢复（FRAP）来阐明生物分子的表面动力学，而另一项研究则侧重于与表面结合的牛血清白蛋白中的能量转移。后者的研究将TIRFM与荧光共振能量转移（FRET），这是目前正在应用中快速增长的另一种技术。

越来越多地使用TIRFM，光刺激和其他技术的趋势是由于*的模块化仪器的可用性越来越高，这使得不必为每个特定的研究应用设计和构建定制系统。另一个重要因素是开发了可应用于各种问题的通用生物学工具，其中重要的可能是利用绿色荧光蛋白（GFP））及其青色，蓝色，黄色和红色衍生物。源自水母的GFP不需要物种特异性的辅因子来表达和展示荧光，可以在物种间进行实验性使用。通过基因重组，生物荧光团已被插入数百种蛋白质中，并且这种潜力基本上是无限的。另一个有前途的能力来自GFP突变体的发展，该突变体在神经递质释放过程中充当细胞内钙的指示剂。在某些研究中，通过荧光共振能量转移对这些蛋白质进行了监测。

TIRFM是研究细胞-细胞相互作用中许多蛋白质的机理和动力学的理想工具。图5展示了使用常规的宽视野落射荧光方法（图5（a））和e逝波照射（图5（b））的活细胞（表达GFP-vinculin的PtK1袋鼠肾上皮细胞）的比较图像。）。TIRFM图像揭示了融合蛋白在底物界面处细胞粘着斑中的定位，与落射照明图像中平面外荧光产生的模糊形成了鲜明的对比。活细胞成像是TIRFM技术前途的应用之一。在细胞膜表面的蛋白质相互作用，例如与粘着斑相关的相互作用，在细胞生物学中具有极其重要的意义。对正常细胞生长所涉及的信号及其因细胞与细胞接触而引起的衰减（接触抑制）的理解，可能有助于洞悉在诸如癌症等疾病中发生的异常细胞生长。

图6-蛋白质动力学的时间间隔序列

在生物分子水平上，已利用TIRFM技术对突变蛋白GFP-Rac的单分子沿基质上生长的细胞的细丝状伪足进行成像（图6）。该蛋白参与细胞运动，因此了解其在细胞膜上相互作用的动力学对于理解该过程至关重要。由于T逝波激发提供了出色的信噪比，因此利用TIRFM可以可视化具有足够动态分辨率的动态分析的单分子荧光。图6 展示了以200毫秒为间隔拍摄的四个连续时间间隔帧，说明了GFP-Rac融合蛋白分子（箭头）通过在基板上长出的非洲爪蟾细胞的细丝脚的运动。

尽管TIRFM仅限于研究盖玻片-标本界面处或附近发生的结构和过程，但同时可以在细胞膜上探查生物学和生物医学领域当前感兴趣的许多问题，这是很幸运的。神经科学领域是众多基本问题都适合通过TIRF显微镜进行研究的领域。应用该技术的理想人选是研究神经递质在突触中的释放和摄取。历*，已经使用遗传，生化和电子显微镜方法研究了膜运输和融合的机制，包括突触囊泡的释放（胞吐）或摄取（胞吞）。

膜片钳技术的发展已使电容测量可用于通过极小的电变化来指示膜表面积的增加或减少或氧化性物质的释放。该技术的缺点是仅检测到融合事件，并且虽然可以实现高时间分辨率，但是关于重要事件的空间位置的信息很少。由于一起检测到所有事件，因此无法获得特异性，并且通常已从结合动力学建模的细胞测量中推断出小泡运输，对接和膜融合的其他阶段的细节。尽管通过电子显微镜进行的研究提供了出色的空间分辨率，但是无法进行活细胞或动态研究，瞬时视图与其他度量的关联非常困难。在近的研究中证明，TIRFM方法的优势在于可以直接目测动态蛋白质-囊泡之间的相互作用。

图7 -TIRF显微镜研究的蛋白质-囊泡相互作用

由于具有光学分辨单个囊泡并直接跟踪其相互作用动力学的能力，TIRFM提供了以的方式研究神经生物学过程中涉及的大量蛋白质的能力。近的一项研究表明，活性区域释放出了含荧光脂质的突触血管，随后囊泡从距质膜20纳米的储备池中转运出来，从而为释放的囊泡提供了补充。另一项研究涉及肌动蛋白在培养的肥大细胞内吞作用动态过程中的作用的直接可视化。观察到GFP-肌动蛋白丝围绕荧光标记的胞囊囊泡，并在肌动蛋白流中将其拉入细胞。延时TIRFM成像序列在图7说明了胞吞过程中的GFP-肌动蛋白动力学。六个连续帧代表0到65秒范围内的不同时间间隔。每帧中的白色箭头表示GFP-肌动蛋白融合蛋白信号。

图8显示了多光谱成像，其说明了胞吞过程中的囊泡-肌动蛋白相互作用。在两个通道的图像中（图8（a）），在细胞外培养基中看到了绿色标记的GFP-肌动蛋白流围绕着含有德克萨斯红葡聚糖的囊泡。三个两通道图像的时间间隔序列（图8（b）至8（d））提供了对在胞饮作用过程中肌动蛋白与囊泡相互作用的时间动态的见解。这种类型的研究可以在逻辑上扩展为使用不同的GFP颜色变体标记许多突触蛋白，以研究其相互作用和动力学。

尽管TIRFM中的标本是二维成像的，但在活细胞研究和固定染色的制剂中，都有一些机制可以获取有关细胞中囊泡或结构位置的三维信息。图9示出了用细胞免疫蛋白化学标记的蛋白质微管蛋白的细胞中的结构，并且使用了宽场落射荧光（图9（a））和e逝波照射（图9（b））对其成像。TIRFM图像中揭示了结构细节，而传统的落射照明无法显示这些细节。通过将它们叠加在伪彩色中来强调两种图像模式的比较。在图9（c）中，落射荧光的颜色为绿色，而TIRFM图像的颜色为红色。

TIRFM的原理表明，通过改变照明入射角，从而改变the逝波的穿透深度，可以在纳米尺度上通过深度区分荧光团。这种精确控制穿透深度的技术在棱镜型系统中更容易实现，并且对该方改进是利用声光偏转器（AOD））以迅速改变入射角。通过the逝场深度的快速变化，可以在不同深度跟踪物镜囊泡或其他结构，并精确确定其位置。AIR在TIRFM中有许多潜在有用的应用，包括用作极快的快门，可以在配备多线激光器的系统中快速调节照明波长。

图8-多光谱囊泡肌动蛋白动力学

如上所述，尽管较新的更高数值孔径的物镜在入射角调节的可用范围上有相当大的改善，但基于物镜的系统中入射角的变化并不像使用棱镜的系统那样容易实现。通常，物镜类型的系统能够检测更多的发射光，并且该信号的强度随距离而单调降低。该特性在校准TIRFM系统时具有优势，因此荧光信号的水平可以与轴向位置相关，从而为三维成像提供了另一种方法。

未来发展前景

现在，TIRFM的基本理论已经确立，并且的发展，该技术的实际实施也得到了极大的促进。因此，正在使用该技术进行越来越多的生物分子和细胞生物学研究。使用激光光源，基于立式或倒置显微镜的TIRFM系统的配置相对简单，如果进行了修改以阻挡通过物镜中心区域的光线，则可以使用常规弧光灯光源来实现。现已提供配置用于TIRFM并结合其他光学技术的完整模块化显微镜系统，并且一些制造商提供专为内部反射应用而设计的高数值孔径物镜，例如Nikon Apo TIRF物镜。TIRFM技术可与多种照明模式兼容，包括明场，暗场，相位对比和微分干涉对比，以及传统的落射荧光。基于物镜的系统的一个特殊优势是，它们可以与各种操纵生物分子的机制结合使用，例如原子力显微镜。TIRFM可能会继续与其他补充技术合并。

在多个波长的活细胞中以高时间分辨率获取图像数据是TIRFM的广阔前景，而且各种染料组合的扩展利用必将比以前更详细地揭示细胞动力学。近，研究人员报道了利用可以在单个波长激发的荧光团进行的双发射波长检测，并且存在通过配置多波长激发系统来进一步扩展TIRFM功能的可能性。随着染料特性的进一步发展和检测器的不断改进，单分子研究将大大增强。TIRFM方法在细胞研究中的扩展可能会通过完善遗传和分子操作技术而继续进行，

图9-宽视野和TIR荧光照明中的细胞结构

因为TIRFM和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）具有某些共同的功能，因此在评估研究问题的可能方法时会自然比较这两种技术。尽管两种技术都提供了光学切片功能，但TIRFM方法仅限于具有适当折射率界面的标本区域，而共聚焦显微镜可以对几乎任何标本平面进行选择性成像。但是，通过共焦方法产生的小光学截面厚度约为600纳米-比TIRFM技术典型的100纳米截面厚得多。在许多应用中，希望地减少进入样品的总照明通量（例如，以减少细胞损伤），并且由于共聚焦仪器照明了相对较大的样品体积，因此使用TIRFM更容易实现。一般来说，配置TIRFM仪器更为经济，该仪器不需要复杂的扫描系统，并且可以在几乎任何现代研究级光学显微镜上构建。许多制造商提供的完整，可配置的系统是TIRFM技术的直接切入点，并具有其他强大的光学成像模式的综合功能。