肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性

一、实验原理

    超氧化物皮化酶(superoxide dismutase， SOD) 在生物体内广泛分布， 能伴化超氧阴离子自由基(O2-.)发生歧化反应，从而清除氧自由基，越到防御氧毒、抗辐射+抗衰老等作用·
    目前因SOD来源不同测活方法非常多， 但是所测酹活结果相差较大丶活性单位也不统一。因此， 本方法是针对植物型SOD对肾上腺素自氧化法的各种影响因素进行了研究， 建立一种微量、快速、稳定重复性好且适用于植物来源的SOD测定方法·

    因植物来源的SOD成分比较复杂， 且有微量的多耐扰氧化物成分。肾上腺素是多耐衍生物， 在碱性条件下会自动氧化， 其中涉及到(O 2-.) 的碰式反应， 可被SOD抑制， 肾上腺素经多步转化为肾上腺素红·上腺素红有480nm和320nm两个吸收峰-325nm处的吸收更能灵敏地反映自氧化程度·当pH z 10.2， 线性范围缩短， pH值越高线性范围越小；pH<10.2时吸光度值极小，易带入误差pH10.2维持着良好的线性段，而且斜率适中，可作为实际应用中的适pH·温度在30℃左右，线性关系较好·着肾上腺素浓度的增加，自氧化速率增大， 线性范围增加， 当肾上腺素液度为0.4mmol/L使每1min自氧化速率达0.070.提高了灵敏度、减少了误差。

二、实验材料及用具

1、实验试剂
植物SOD样品(申叶松香草提取) lg pH 7.5质量液度0.05mol/L的磷酸钠缀冲液、两雨*0.4mmol/L肾上腺素溶液+50mmol/LpH为10.2的Na2CO 3-NaHC 03缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠双蒸水+100mmol/L盐酸液， 内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠

2丶实验器具
试管30m、紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、PHS·3C精密pH计

三、实验步骤

1配置溶液：配置pH 7.5质量浓度0.05mol/L的磷酸钠缓冲液·50mmol/LpH为10.2的Na2CO 3-NaHCO 3缓冲液及0.4mmol/L肾上腺素溶液(62：38) ；

2植物SOD样液的制备·将植物SOD样品， 加入pH 7.5质量浓度0.05mol/L的磷酸钠缓冲液， 于4℃条件下3500转/min离心15min， 取酵液， 加入-20℃预冷两酮， 取沉淀物落于少量重蒸水中， pH 7.5、质量淬度25mmol/L的磷酸钠透析即得酵的粗提液。

3、将配置好的50mmol/LpH为10.2的Na2CO 3-NaHC 03缓冲液放到30℃±0.5℃的恒温水溶锅中保温20min；

5将配置好的溶液分别放到325nm的分光光度计下测其吸光值， 每隔lm in记一次
吸光值，连续读取14分钟；(试验中保持溶液温度在30oC)

6、绘制时间一OD曲线图，并分析结果

四、活性测定
肾上晾素法的活力单位定义：30℃时， lml反应液中每分钟抑制肾上腺素自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。
酵活性计算公式：
U/mg=(0.070-AA325)x100%xV总/[0.070×50%·V。-VS]
其中：
AA325：反应吸光值变化值；
V总：反应总体积(mL)；
VS：加入样品液的体积；
Va：活力单位定义体积(lmL)