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分配色谱的原理及操作方法

2019年04月04日 15:39人气：3313

　　【中国仪器网使用手册】一种物质在两种互不相溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，在同一温度下，该物质在两相溶剂中浓度的比值是恒定的，这个比值就称为该物质在这两种溶剂中的分配系数。在天然药物提取分离工作中常用的溶剂萃取，就是利用天然药物中化学成分在互不相容的两相溶剂中的分配系数不同从而使其达到分离的。如果需要分离的物质在两相溶剂中的分配系数相差很小，则一般用液-液萃取的方法是无法使其分离的，必须使其在两相溶剂中不断的反复分配，才能达到分离的目的，而分配色谱就能起到使其在两相溶剂中不断的进行反复分配提取的效用。

　　分配色谱的基本原理

　　分配色谱法是用一种多孔性物质作为支持剂，将极性溶剂在色谱过程中始终固定在支持剂上，因它在色谱过程中始终是不移动的，故称之为固定相。用另一种极性较小的溶剂来洗脱，因它在色谱过程中始终是移动的，故称为移动相。由于移动相连续的加入，混合物中各成分一次又一次的在固定相与移动相之间按其分配系数进行无数次的分配，实际上就是移动相把成分从固定相中连续不断的提取出来并向前移动。结果是在移动相中分配量大的成分移动速度快，走在前头；在移动相中分配量小的成分移动速度慢，走在后头，从而使混合物中各成分达到彼此分离的目的。将支持剂装在柱中的称为柱分配色谱，以滤纸作为支持剂的称为纸上分配色谱。

　　柱分配色谱所用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素等。硅胶由于规格不同，往往使分离结果不易重现。硅藻土由于所含的氧化硅质地较致密，几乎不发生吸附作用。用纤维素作为支持剂进行分配色谱，实际上相当于纸色谱的扩大。

　　使用分配色谱的分离工作难易主要决定于混合物中各成分的分配系数的差异，如果分配系数相差较大，只要用较小的柱和较少的硅胶(支持剂)就能获得满意的分离。如果分配系数相差较小，则分离同样重量的样品往往需要用较大的柱和较多的硅胶才能分开。通常在溶剂萃取中，所用的两相溶剂比大致为1:1，而在分配色谱中移动相的体积常常大于固定相5-10倍，在某些情况下甚至更大，即相当于以5-10倍甚至更大体积的有机溶剂向水溶液萃取，而分配系数的含义为溶质在两相溶剂中的浓度比，若体积增大，实际抽提出的量也大。因此在分配色谱中选择固定相和移动相时，要考虑样品在两相溶剂中的分配比(样品在移动相中的浓度/样品在固定相中的浓度)，通常其分配系数选择在0.1-0.2为宜。分配系数较大时，则很快会从柱上被洗脱下来，分离效果较差。如果分配系数过大则可采用反相分配色谱的方法进行分离，即以极性较小的溶剂作固定相，极性较大的溶剂作移动相。

　　原则上各类化合物均可用分配色谱的方法进行分离，但在实际工作应用中由于反相分配色谱是用得较少，主要是用于一些水溶性较大的化合物的分离如皂苷类、糖类、氨基酸类、极性较大的强心苷类、有机酸类、酚性化合物等。

　　分配色谱的一般操作

　　分配色谱的基本操作与吸附色谱大体相同，但也有它的特殊性，在使用时要引起注意，否则会直接影响它的分离效果。

　　1．装柱

　　装柱前要先将支持剂与一定量的固定相搅拌混合均匀，然后将混有固定相的支持剂倒入盛有移动相溶剂的柱中，按一般湿法装柱操作方法进行操作。通常支持剂和固定相溶剂的用量比为1:0.5-1.0，即1克支持剂加0.5-1克固定相溶剂。因分配色谱是使用不相互溶的两种溶剂，所以必须预先使两相溶剂相互饱和，即将两相溶剂放在一起振摇，待分层后再分别取出使用，至少移动相应先用固定相饱和后再使用。否则，在色谱进行过程中当通过大量移动相溶剂时，就会把支持剂中的固定相溶剂溶解出来，后只剩下了支持剂，也就不成为分配色谱了，并有可能导致整个分离的失败。

　　色谱柱固定相支持剂段直径与长度的比为通常为1:10-20，，对分配系数比较接近的成分的分离，往往可加大到1:40以上。一般一米长的色谱柱的分离效果能相当于数百支逆流分溶管或数百个分液漏斗的萃取效果。

　　支持剂的用量通常较吸附色谱大，一般样品与支持剂的用量之比为1:100-1000。其具体用量主要取决于分离工作的难易，对分配系数比较接近的成分的分离甚至可采用1:10000。

　　物质的分配系数往往会因温度的变化而改变，因此对要求较高的实验，色谱管好有隔层套管，以便通水保持恒定的温度。

　　2．样品的加入

　　样品上柱有三种方法：如样品能溶于移动相溶剂，可用少量移动相溶剂溶解，加于柱顶再行展开；如样品难溶于移动相而易溶于固定相时，则可用少量固定相溶剂溶解，再用支持剂(硅胶)吸着，装于柱顶再行展开；如果样品在两相溶剂中的溶解度均不大，则可另选其他有机溶剂溶解后，加干燥支持剂拌匀，待溶剂挥发除尽后，加0.5-1.0倍量固定相溶剂拌匀，再装于柱顶。

　　3．洗脱

　　加样完毕后，用移动相溶剂进行洗脱，分别收集各馏分，回收溶剂，用薄层色谱等方法检查，相同者合并。所用的移动相溶剂常为固定相溶剂的5-10倍，即相当于用5-10倍体积的有机溶剂向水溶液反复提取(如果以水为固定相)。

　　在分配色谱进行过程中，要尽量使溶质在两相溶剂之间达到平衡，故移动相溶剂的流速应慢些。通常要根据色谱柱的横断面和成分的分离难易程度来调整流速。

　　4．溶剂系统的选择

　　主要根据有效成分和杂质的溶解度来选择适当的溶剂系统，也可借助硅胶分配薄层色谱或纸层色谱的结果来摸索分离条件，或者查阅前人分离同类型化合物时的资料作为参考。一般来讲，生物碱类或酸性物质可用缓冲溶液作固定相。

　　近年来，在使用硅胶柱色谱分离皂苷等极性较大的化合物时,常以含水的溶剂如氯仿-甲醇-水、二氯甲烷-甲醇-水等作为洗脱剂，由于在洗脱过程中硅胶会逐渐吸附洗脱剂中的水，使硅胶中的水分逐渐增大，故可以认为该类色谱开始时是脱活硅胶的吸附色谱，但随着硅胶中水的增多即固定相的增加，就逐渐变为硅胶分配色谱了。

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