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液氮低温对生物大分子的影响

2018年01月25日 17:32人气：2163 来源: 上海京灿精密机械有限公司 >> 进入该公司展台

　　生物样本库中用于提取生物大分子的组织样本一般直接投入液氮，并储藏在液氮或者-80℃冰箱。目前认为低温下基本不会发生生物大分子的降解，样品可以用于各种分子检测。但是由于RNA与蛋白质的不稳定性，长时间保存也可能带来不同程度的降解。

　　添加低温保护剂保存可以使细胞保持活性，但是由于冰晶损伤、渗透压损伤及保护剂等外来物质的添加，不可避免会给细胞带来一定程度的损伤。这些损伤可以是形态上的，也可以是功能上的，还可以是细胞内生物大分子的降解或突变等。

　　低温对细胞、组织形态结构及功能的影响

　　低温保存过程中由于冰晶的形成和渗透压的改变，会引起细胞膜的受损和皱缩，进而也会导致细胞、组织形态和功能发生改变。有大量实验表明细胞膜和细胞器的受损与胞内冰晶的形成具有很大关系。而样本库目前采用的直接冻存法会破坏细胞膜，使细胞和组织丧失正常的功能，不再加以探讨。

　　低温对生物大分子的影响

　　低温保存技术对生物大分子的影响直接决定了该技术能否应用于生物样本库。只要生物样本置于低于正常生理温度的环境下，都会对细胞产生寒冷刺激，这种来自外界的刺激会对细胞正常的生理代谢产生影响，从而影响生物大分子的质量或表达，只是由于温度高低和时间长短的不同，影响大小会有差异。从分子水平来看，冷冻对膜磷脂、蛋白质和核酸的影响是通过改变疏水和亲水反应决定的结构实现的。

　　低温对DNA的影响

　　对生物样本中DNA的关注集中在基因信息的完整性与突变。目前认为直接冻存法能比较好的保存DNA信息。研究表明生物样本库中保存的肿瘤组织保存5年之内，DNA分子的完整性与质量均未受影响。宋博等采用改进后的单细胞凝胶电泳(SCGE)对-80 ℃条件下保存不同时间的精子DNA进行分析，认为冰冻对精子质量无显著影响。而Fairbairn等的研究认为直接冰冻会使组织DNA受损，但是储藏时间的延长并不会引起损伤加剧。Ross等的研究则认为血液样本直接冻存在-70℃后再提取DNA比提取DNA后再冻存产量要减少25%。因此直接冻存法对DNA的影响根据储藏对象的不同还是存在差异的。

　　低温对RNA的影响

　　直接冻存法与冻存时间对RNA的影响研究也是主要集中在完整性，普遍认为保存较长时间后会发生降解，并且和保存对象的特征有关。认为RNA与蛋白质分子在低温保存1-2年内尚不影响癌基因表达的分析结果，但低温保存3年或以上的标本中RNA及蛋白质均有不同程度降解。路俊锋研究认为直接冻存法(离体30min内直接放入-80 ℃冰箱)保存的脑胶质瘤组织比瘤周组织RNA的降解程度小，这说明同样的保存方法对不同组织RNA具有不同的保存效果。Olivier研究表明RNA储存在-140 ℃，RIN值变化与时间长短之间无显著关系。而在-80℃储藏8个月后，浓度为250 ng/μL时RNA完整性保存完好，而浓度为25 ng/μL时显著降解。Botling等评估了复温对直接冻存的组织样本中RNA的完整性和基因表达的影响，认为RNAlater能更有效的阻止RNA的降解，而冷冻组织复温后30min以上会发生较大程度的降解，并伴有FOS和BCL-2基因表达的变化。

　　低温对蛋白质的影响

　　低温对蛋白质的影响比较大，有针对酶功能、二级结构、表达量等多方面的研究，多数研究还是认为低温会对蛋白质带来一定的影响。

　　MMP-9(基质金属蛋白酶-9)，是一种在临床研究中用于检测心血管风险的标志物，Rouy等发现血浆储藏在-80℃，MMP-9会随着时间的延长发生降解，24个月后下降到65%，43个月后下降到1%。

　　冷冻时细胞内的蛋白由于暴露在高浓度的溶液中会发生不可逆的结构转变。蛋白会由于ROS的产生受到自由基影响，还会由于在冷冻复温过程中溶酶体膜破裂释放出的蛋白酶而降解。Feridoun的研究结果也表明冻存后的肺癌和乳腺癌细胞表面蛋白表达量下调。

　　一些蛋白质可能会在很低的温度下（＜-80 ℃）保持活性。因此，当生物样本贮存在水还具有流动性且蛋白也具有活性的温度下时，也会导致其降解。

　　低温对脂类的影响

　　脂类物质作为生物标记物用于分子诊断等检测的主要是游离脂肪酸，侯文华等的研究认为血清样本4℃下放置4 h血清游离脂肪酸浓度与即刻结果无统计学差异，而放置8h、24 h、48 h后均明显升高，-20℃冷冻条件下放置24 h后血清游离脂肪酸浓度与即时结果之间无统计学差异，而放置48h后与即时浓度之间有统计学差异。

　　细胞膜主要是由双层磷脂膜构成，当希望保存完整细胞结构时就必须考虑低温对脂肪带来的影响，并且冷冻造成的脂类物质的变化可能会导致细胞生存环境的变化。

　　冷冻会改变脂肪的物理状态，从而改变其组织结构和流动性，因此细胞膜的磷脂双分子层结构会发生变化。Wolkers的团队对冷冻和冷藏时细胞磷脂膜的损伤做了深入的研究，发现红细胞在4 ℃冷藏5天后，会出现多重急剧的膜相转移，这说明膜磷脂发生了相分离。

（本文来源：上海京灿精密机械有限公司，转载请注明出处）

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