超微量紫外分光光度计的应用

      超微量紫外可见分光光度计是通过检测物质波长处或某一波长范畴内光的吸收度，对物质进行定量与定量分析的仪器设备，目前已成为现代分子生物学、药物学、食品科学等领域的常用仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。  

1、核酸的定量  

  核酸的定量是超微量分光光度计使用频率的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

2、核酸的纯度检测  

  除了核酸浓度，超微量分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如：  

（1）A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。  

（2）A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。   

3、蛋白质直接定量  

  这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。超微量分光光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm的"背景"信息，设定此功能"开"。与测试核酸类似，要求A280的吸光值大于0.1A，的线性范围在1.0-1.5之间。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单;但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。  

4、比色法蛋白质定量（颜色反应）  

  蛋白质比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。  

比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。  

由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。所以在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。  

5、OD600（菌落密度）  

  实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。通过检测600nm处细胞生长培养的吸光度，从而监测微生物或其他细胞培养的生长率。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。

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