，

实验原理：

样品中的* 及* 经皂化处理后，将其不可皂化部分提取至有机溶剂中。用液相色谱法C18反相柱将* 和* 分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。该法zui小检出量分别为：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng.
三、仪器和试剂
仪器
高压液相色谱仪带紫外分光检测器、旋转蒸发器、高速离心机；小离心管：具塑料盖1.5~3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）、高纯氮气、恒温水浴锅、紫外分光光度计。
2.试剂
实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。
1.无水yi醚：重蒸，不含有过氧化物。
过氧化物检查方法：用5mL yi醚加1mL 10%*溶液，振摇1min。如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。
去除过氧化物的方法：瓶中放人纯铁丝或铁沫少许，重蒸yi醚。弃去10%初馏液和10%残馏液。
2.无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质。
检查方法：取2mL 银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
银氨溶液：加氨水至5%银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数
滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。
脱醛方法：将2g 银溶于少量水中，4g 氢氧化钠溶于温乙醇中，然后将两者倾入1L 乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时．银用量适当增加。
3.无水钠。
4.甲醇：色谱纯或分析纯重蒸后使用。
5.重蒸水：蒸馏水中加少量*，临用前重蒸。
6.10%抗坏血酸溶液（W/V）：临用前配制。
7.50%氢氧化钾溶液（W/V）
8.* 标准液：*（纯度85%）或*乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解* 标准品，使其浓度大约为1mL 相当于1mg *。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度.
9.* 标准液: α-生育酚（纯度95%），γ-生育酚（95%），δ-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种* 标准品，使其浓度大约为1mg/mL。临用前用紫外分光光度分别标定此三种* 的准确浓度。
10.内标溶液：称取苯并[e]芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成每5μg/mL 苯并［e］芘的内标溶液。
11.pHl－14试纸，
四、操作步骤
（一）样品处理
1.皂化
称取1～10g 样品（含* 约3ng，* 各异构体约为40ng）于皂化瓶中，加30mL 无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸、苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。再加10mL50%氢氧化钾，混匀。于沸水浴回流30min 使皂化*。皂化后立即放人冰水中冷却。
2.提取
将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL 水分2~3次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL yi醚分两次洗皂化瓶及其残渣，yi醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。
3.洗涤
用约100mL 水分次洗分液漏斗中的yi醚层，直至pH 试纸检验水层不显碱性（zui初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。
4.浓缩
将yi醚提取液经过无水钠（约5g）滤入250～300mL 旋转蒸发瓶内，用约50 mL yi醚冲洗分液漏斗及无水钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收yi醚，待瓶中剩下约2mL yi醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉yi醚。加入2.00 mL 乙醇，充分混合，溶解提取物。
5.离心
将乙醇液移入小塑料离心管中，3000rpm 离心5min。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。
（二）标准曲线的制备
1. * 和* 标准浓度的标定方法
取* 和各* 标准液若干微升，分别稀释至5.00 mL 乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。
2. 标准曲线的制备
本方法采用内标法定量。将一定量的*、α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘液混合均匀；选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70%，为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点（其内标苯并［e］芘的浓度值不变）．用此种浓度的混合标准进行色谱分析。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。
本方法不能将β-E 和γ-E 分开，故γ-E 峰中包含有β-E 峰。
（三）液相色谱分析
1.色谱条件（推荐条件）
预柱： 5μm，4mm×10cm；
分析柱：hypersil ODS 5μm，4.6mm×25cm ；
流动相：甲醇：水=98：2；混匀，于临用前脱气；
紫外硷测器波长：300nm；量程0.02；
进样量：20μL 进样定量环；
流速： 1.65~1.70mL/min
2.样品分析
取样品浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。
定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。
定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。
五、计算
X=C/m×V×100/1000
X—某种维生素的含量（mg/100g）；
C—由标准曲线上查到某种维生素含量（μg/mL）；
V—样品浓缩定容体积（mL）；
m：样品质量（g）。
用微处理机二点内标法进行计算时．按其计算公式计算或由微机直接给出结果。结果的允许测定结果相对偏差值≤10%