液相色谱柱的使用

色谱柱在使用前，进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是*条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

1、样品的前处理

a、使用流动相溶解样品。

b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，

因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中

(或长时间保留在柱中)。

b、流动相与样品不产生化学反应

c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱要追求*柱效，使用*流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用*流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相 的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：  

a．含水流动相在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要隔夜。加入*，防止细菌生长。  

b．流动相要求使用0.45µm滤膜过滤，除去微粒杂质。  

c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

色谱柱的维护 

注意：  

a．含水流动相在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要隔夜。加入*，防止细菌生长。  

b．流动相要求使用0.45µm滤膜过滤，除去微粒杂质。  

c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。  

1.色谱柱的维护 

甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得zui大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：  

a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡） 

b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。 

2．色谱柱的再生  

长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。 

建议用来冲洗柱子的溶剂体积    色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积    125-4mm1.6ml30ml    250-4mm3.2ml60ml    250-10mm20ml400ml  

选择再生方法：  

  极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：    正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**  

  非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水  

注意：  

a.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液*流出。  

b.0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够*洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。 

3.色谱柱的维护 

a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）  

b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围  

c．避免流动相组成及极性的剧烈变化  

d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理 

e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中  

f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀

1 、色谱柱的使用说明：

( 1 )、 色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用 10 ％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

( 2 )、 流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过 0.45μm 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
 以常规硅胶为基质的键合相填料通常的 PH 值适用范围是 2.0-8.0 ， BDS C18 适合于碱性化合物， PH 值适用范围为 2.0-10.0 。当必须要在 PH 值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并*置换掉原来所使用的流动相。
( 3 )、 样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱( SPE )对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2 、色谱柱的保存

( 1 )、 反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用 10% 的甲醇 / 水冲洗 30 分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗 30 分钟。 注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入 10% 的甲醇，防止将填料冲塌陷。

 ( 2 )、 长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂*或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度是室温。

3 、色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
( 1 )、 反相柱的再生 ： 依次采用 20-30 倍的色谱柱体积的甲醇：水 =10 ： 90 ( V/V )，乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
( 2 )、 正相柱的再生 ： 依次以 20-30 倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4 、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中zui常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外)，可能的原因有如下几点：

( 1 )、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

( 2 )、色谱柱头的填料被样品污染；

( 3 )、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

( 4 )、流动相 PH 值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下：

( 1 )、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在 10 ％的稀硝酸内超声清洗 10 分钟，后再用纯水超声 10 分钟，重新装入色谱柱。

( 2 )、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
( 3 )、如确定定是盐结晶，用 10% 的甲醇 / 水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
( 4 )、如果因 PH 值使用不当，很难恢复。