ASMS2020赛默飞线上预热讲座集锦第四期：生物大分子表征新技术

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疫情并不能停止分析科学家们技术交流与分享，6月1-12日，质谱界盛会—第68届美国质谱年会，在线上盛大举行。在此之前，赛默飞举办了线上预热讲座，内容涵盖LC-MS新产品，以及蛋白组学、生物制药、代谢组学等应用方向，所有内容现在仍可通过注册进行线上观看。

前三期，与大家分享了新仪器的应用，蛋白组学的新技术与热点，后这期与大家分享讲座中的生物大分子表征新技术。

多样化液相串联质谱技术用于完整分子量表征

近年来，随着非变性质谱技术的日趋成熟，生物大分子完整分子量表征方法的多样性也随之增加，如色谱及电泳技术与质谱联用等方法。

非变性质谱进行完整分子量分析的主要优势包括：

1色谱高通用性；

2分析速度快且样品使用量小；

3质谱的高分辨性能及出色的峰容量可获得高质量质谱图。

非变性质谱已被工业界快速接受，作为完整水平的质量属性监测强有力的分析方法。此外，非变性质谱也能够在表征实验室与QC实验室之间建立强大的关联。本讲座介绍了完整分子量分析的技术重点及方法的稳健性，包括不同质谱平台间方法转换对数据的影响（从Q Exactive plus到Exploris 480）。

赛默飞完整分子量分析平台包括Vanquish Duo双三元超高效液相、Exploris 480超高分辨质谱、变色龙数据管理系统，及Protein Metrics数据分析软件。

图.赛默飞完整分子量分析平台（点击查看大图）

01

SEC平台

在线SEC-MS作为简单且稳健的分析平台，可实现高通量生物大分子聚集体分析。Vanquish Duo液相平台可以使用两根色谱柱同时进行分析和再平衡，当一根色谱柱在分析时，另一根色谱柱在平衡，可以大程度节约分析时间，提高分析通量。

图.Vanquish Duo实现高通量分析（点击查看大图）

经过液相分离得到的每个色谱峰经过质谱检测，能够获得对应的单体及聚体的分子量及糖型信息。同时，orbitrap的超高分辨性能可实现每个糖型的基线分离，在非变性条件下得到更准确的分子量信息。方法稳健性的测试，连续进样413次，每24次进一针参比品，17针参比品的色谱叠加图显示保留时间及色谱峰的RSD值在3%以内。不同实验室使用不同批次SEC色谱柱，多次技术重复实现结果显示，单体及聚体的糖型含量保持一致，具有良好的重现性。

图.非变性质谱平台的稳健性（点击查看大图）

02

质谱平台转移

将非变性质谱平台从QE Plus转移至Exploris 480上，并做了方法验证和对比。Exploris 480，45K分辨率时，可在保证高信噪比的同时实现好的分辨率，能够分辨相差25Da的两个糖基化修饰峰，可作为Exploris 480分析完整蛋白时合适的分辨率。上样量从1ug到10ug递增，谱图均有良好的信噪比，且糖型相对含量一致。

图.Exploris 480分辨率和上样量参数优化（点击查看大图）

QE Plus及Exploris 480的质谱数据（多样本且技术重复）对比显示，在完整水平上鉴定的糖型及含量高度一致，证实了方法转移的可行性（如下图所示）。

图.QE Plus及Exploris 480数据对比（点击查看大图）

03

CIEX平台

通过使用可挥发性盐流动相及PH梯度分离，可实现在线CIEX-MS分析，如下图a所示，对于多种单抗混合样品，可获得良好的色谱分离及高质量质谱数据（可分辨相差几十Da的糖化修饰峰）。稳定性实验中，通过CIEX-MS分析，能够观测到碱性峰中的琥珀酰亚胺中间体产物的增加（图b）；加速稳定性实验中，能够观测到抗体片段的变化（图c）。

图a.CIEX-MS分析多种单抗混合物（点击查看大图）

图b.CIEX-MS分析抗体稳定性实验中的碱性峰变化（点击查看大图）

图c.CIEX-MS分析抗体加速稳定性实验中的片段峰变化（点击查看大图）

总结

生物大分子完整分子量分析在工业界已是一种广泛认可的分析方法，多样性的前端液相串联质谱（如反相，离子交换，体积排阻色谱等）平台已被开用应用。基于orbitrap的质谱平台能够获得更高分辨及稳健性的数据，且能够在不同orbitrap质谱型号间进行方法转换。对于完整蛋白糖型表征，抗体片段分析，琥珀酰胺化修饰、氧化修饰等杂质能够进行高通量且准确分析。

PRCR技术与MS3在抗体Middle-down蛋白分析中的应用

ASMS 2019，赛默飞重磅推出三合一系列的创新dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™质谱仪，*的PTCR技术可通过气相的离子-离子相互作用，将蛋白质的质子转移给特定的化合物（C??F??），从而造成蛋白质本身电荷减少，得到一系列的电荷减少离子。

采用Middle-down质谱分析减少了样品前处理操作，降低了人为引入翻译后修饰的风险，可以更好的获取抗体的序列信息。结合使用PTCR技术后，通过降低母离子和/或子离子的价态，帮助解析复杂的MS及MS?谱图，可检测到更多的母离子及碎片，对结构生物学以及生物制药的应用大有助益。

讲座中简要介绍PTCR技术结合MS3与SPS同步母离子扫描技术在Middle-down蛋白分析中的应用。PTCRMS3分析策略如下，方法设置中shou选会用四极杆选择某一价态的母离子，随后根据方法设置按照不同的碎裂模式，如ETD，HCD，UVPD进行二级碎裂，产生的碎片离子与PTCR离子发生三级反应，终获得的碎片离子进入Orbitrap进行质量分析。

以NIST mAb为例，进行middle-down分析前，先使用Ides酶对单抗进行酶切，然后将单抗还原成LC，Fd，Fc三条分子量约为25kDa的亚基。以分子量大的Fd的序列覆盖结果为例，单独使用ETD的Fd序列覆盖度为52%。ETD碎裂模式结合PTCR-MS3可以将序列覆盖度提高至63%，同时使用PTCR后对于分子量大于5kDa的碎片识别率有了显著的提高。

PTCR与HCD碎裂模式联合使用时，同样也会提高鉴定效率。以Fd为例，PTCR-MS3虽然只是略微增加了Fd的序列覆盖度，但是互补离子对的数量有了显著增加，从0对增加到了7对。结合两者的数据可以将序列覆盖度增加到41.6%，同时互补离子对增加到8对。

PTCR与UVPD联合使用时，可以将LC的序列覆盖度从64.6%提高至74%。将单用UVPD和PTCR联用的结果整合，则可以将LC的序列覆盖度提高至84.4%，互补离子对的数量也有了显著增加。

常规的PTCR-MS3分析会将二级碎片按照质荷比进行分段，成为两个质谱分析方法，分多针进样分析。为了减少进样数量，在一针方法里实现多段质量轴的二级碎片的PTCR反应，可结合SPS同步母离子扫描技术。以UVPD碎裂为例，将SPS窗口设置为目标质量范围，实现一针进样，多段分子量的PTCR分析。

SPS结果显示，优化了PTCR和UVPD反应时长后，可以实现LC 54%的序列覆盖，虽然不及多针进样模式下的结果，但仍然可以看出SPS技术应用在PTCR分析中，减少进样数量、缩短进样时间的可能性。

总结

Eclipse上*的PTCR（质子转移电荷减少）技术可以将蛋白上的质子转移给特定离子，简化蛋白分析中原本十分复杂的质谱图。联合PTCR与其他碎裂模式（ETD，HCD，UVPD），使二级碎片与PTCR离子发生三级反应，降低碎片谱图的复杂程度，可增加抗体蛋白middle-down分析的序列覆盖度。

学习使人快乐，通过四期的分享，希望大家都能从中获得快乐。

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