内毒素对细胞培养和生物技术的意义

　　生物制药生产商对内毒素有两个担忧。首先，注射成品中的内毒素含量必须低于内毒素限值。这一问题适用于所有注射药物、生物制品和无热原医疗器械。这方面的文献记载很多，本文不再讨论。第二个问题是内毒素对用于生产生物制药的表达系统和产品本身的影响。

　　内毒素对不同细胞类型或细胞系的影响差别很大。我们应该了解内毒素对相关细胞的影响，以便采取适当的控制措施。即使是母细胞系和子细胞系，对内毒素的敏感性也可能大相径庭。1对所用的细胞表面受体的认识可以提醒研究者注意潜在的内毒素敏感性。人体细胞上的CD14受体与内毒素敏感性密切相关。当培养基中含有血清时，这一点尤为重要。血清成分，如脂多糖结合蛋白(LBP)和septin复合物，可增强CD14细胞对内毒素的激活作用。相反，一些哺乳动物和脊椎动物的细胞系统对内毒素具有耐受性。细菌和酵母培养基中内毒素的存在通常不是一个问题。下文将举例说明内毒素对生物系统的影响。

　　在涉及细胞培养的研究中，必须防止因生物对污染物的反应而产生的虚假结果。此外，还必须将产物的特性与污染物内毒素的特性区分开来，细胞因子尤其如此。

　　一、膜和形态学效应

　　内毒素是革兰氏阴性菌的两亲性膜成分。它可能会干扰其他细胞的膜结构和功能，这并不奇怪。内毒素通过磷酸基团与阳离子蛋白质发生反应，其脂肪酸链则与脂质膜和蛋白质的亲水区发生作用。内毒素与细胞膜的相互作用可能表现为明显的形态学变化，如中国仓鼠卵巢细胞膜紊乱、表面褶皱和细胞器增多、细胞质中出现大液泡、形态学损伤和己糖摄取减少、和严重的膜损伤。有时形态变化暴露于清洁介质后是可逆的。此外，不同的内毒素对形态学的影响也不同。

　　情况严重的话，内毒素对细胞膜结构和功能的影响可能具有细胞毒性。不同内毒素和不同细胞系之间的毒性程度各不相同。然而，至少有一些细胞可能诱导对内毒素的耐受性。

　　二、分泌/生产

　　细胞膜对细胞产物的合成至关重要，内毒素会影响这一合成过程。这显然是细胞研究和商业细胞系开发的关键问题。细胞的敏感性是多种多样的;例如，从内毒素反应亲本中克隆了两种无反应的T细胞系。此外，内毒素的反应可能会受到其他因素的影响，如温度。

　　内毒素对体外单细胞产生细胞因子的影响已被广泛报道。内毒素被认为是肿瘤坏死因子(TNF)产生的最you效刺激物。已经注意到对转录的影响，并且已经提出刺激的主要调节可能发生在这个水平上。

　　除细胞因子外，一系列细胞产物也受到内毒素的影响。哺乳动物细胞合成受到刺激或增强的产物包括前列腺素、酸性磷酸酶、6纤维蛋白溶解抑制剂、胶原酶生成、神经生长因子、B因子分泌、多肽、血小板激活因子、粘附抑制剂、粘附分子-和促凝剂(剂量依赖性)。

　　已观察到内毒素对血管紧张素转换酶活性33、蛋白多糖23和α2 巨球蛋白34的合成有抑制作用。这些反应可能与剂量有关，在某些情况下，不同的内毒素会产生不同的反应。例如，在某些剂量下，乳杆菌内毒素会刺激磷酸酶的产生，而大肠杆菌内毒素则会抑制磷酸酶的产生。

　　三、有丝分裂

　　内毒素对某些哺乳动物细胞类型和品系具有强烈的有丝分裂作用。这种效应会给易感细胞的培养带来问题。另一方面，一些历史悠久的细胞系对培养基中的高浓度内毒素具有耐受性。有报道称，有丝分裂性与几种不同内毒素的LAL反应性和热原性之间存在相关性。35然而，正相关性并不总是很明显，同样有丝分裂性的内毒素在LAL反应性和热原性方面可能存在显著差异。因此，LAL活性不是内毒素有丝分裂性的良好预测指标。

　　一些有丝分裂原受到内毒素的严重污染，其高浓度使人怀疑内毒素对其有丝分裂作用的影响。有报道称，内毒素和有丝分裂的作用具有相似性。

　　更为复杂的是，内毒素可以抑制细胞分裂，与刺激有丝分裂一样，这些作用取决于内毒素的来源。可能存在浓度依赖性效应，从促进有丝分裂到抑制更高浓度的有丝分裂。值得注意的是，一些常用有丝分裂中的内毒素浓度与某些细胞系中抑制细胞分裂的内毒素浓度一样高。

　　四、其他影响

　　文献中报道的内毒素对其他体外细胞的其他影响包括：影响粘附性、胰岛素结合和内吞作用的减少、42TNF结合位点的丧失保护细胞免受HIV感染、杀瘤活性以及钾电流和钾通道数量的增加。

　　五、多重效应和协同作用

　　内毒素引起的多种生物反应可能造成因果关系的混乱。内毒素对细胞产物分泌的影响可能是间接的。例如，干扰素抗体可阻止内毒素对弹性蛋白酶分泌的明显抑制作用。这表明细胞产生的干扰素导致了抑制作用。在抗体存在的情况下，内毒素实际上增加了弹性蛋白酶的分泌。因此，抑制作用是继发性的，是由于内毒素刺激了干扰素的产生。

　　同样，培养的心脏细胞产生的脂肪酶产生80%的抑制作用是由细胞产生的内毒素诱导的TNF介导的。这些观察结果是一个明确的警告，观察到的影响可能是内毒素暴露的间接后果。类似地，有丝分裂性可能是次要效应。内毒素刺激巨噬细胞和中性粒细胞产生IL-1已被证明在脾脏细胞中有致裂作用。49在这种情况下，这种作用是由牙龈拟杆菌的内毒素引起的，而不是由肠道细菌引起的。淋巴因子和内毒素之间有趣的协同作用可诱导巨噬细胞产生化学发光，这种反应已被建议作为细胞毒性试验的替代品。

　　在另一项研究中，内毒素与细胞因子在同一系统中既有协同作用，也有拮抗作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子使细胞对内毒素产生反应，从而诱导TNF的产生。TNF刺激lL-6的产生，从而在负反馈循环中抑制TNF的进一步产生。

　　六、体外受精

　　体外受精是组织培养技术的一种特殊应用。在低内毒素浓度的培养基中可以提高受精率。在培养基中检测不到内毒素的情况下(检测限为0.1ng/ml)，怀孕率为27.2%，而在含有内毒素的情况下，怀孕率仅为6.3%。内毒素存在时，形态学和超微结构发生明显变化。在另一项研究中，在内毒素浓度高于1ng/ml时，观察到孕体中碎片的程度不断增加。当内毒素浓度低于1ng/ml时，卵母细胞受精率为66%，而当内毒素浓度大于1ng/ml的时候，受精率为53%。比较妊娠情况时，差异更为明显。当培养基中内毒素浓度超过1ng/ml时，妊娠率为8%，未检测到内毒素(0.1ng/ml)时，妊娠率为32%。

　　七、结论

　　由于细胞对内毒素的反应千差万别，因此无法确定内毒素开始干扰细胞功能和生长的临界水平，也不可能说明这种干扰可能采取的形式。内毒素的影响和所讨论的细胞的敏感性只能通过在没有可检测到的内毒素的培养基中培养细胞来确定。这可能可行，也可能不可行。如果可行，可以确定临界污染水平并设定限制。

　　人们早已认识到内毒素对细胞过程的影响。由于血清在细胞培养基中的广泛使用.人们对血清的内毒素污染给予了特别关注。Fumarola和Jirillo55.56强烈呼吁人们认识到内毒素对细胞系的影响，以及适当降低内毒素浓度的必要性。他们指出，“生物学中常用的一些制剂受到内毒素污染，可能会产生错误的结果。"至少有一种说法认为组织培养基中“绝dui不存在"内毒素。这些作者还讨论了使用内毒素刺激细胞并提高其反应性的问题，但显然是以受控的方式。

　　应尽量减少产品的内毒素污染，而不仅仅是因为担心热原性和内毒素限值。一些生物技术产品的特性是与内毒素相同的。58如果制剂被内毒素污染，就无法对这些产品进行适当评估。研究人员使用End-X B15内毒素亲和树脂(美国ACC)的经验很好地说明了这一点。从蛋白质溶液中成功地去除了内毒素，远低于令人担忧的水平，该蛋白质的特异酶活性不受处理的影响。然而，该制剂的有丝分裂活性却急剧下降。研究人员最终得出结论，原始制剂的有丝分裂性可能是由于大量内毒素污染造成的，而不是蛋白质的固有特性。

　　内毒素污染的问题应该在产品开发的早期解决，当然也应该在扩大规模之前解决。这样既能zui大限度地减少有害影响，又能正确确定产品的特性，对内毒素相关问题的及早关注可能会持续到全面生产。当内毒素规范对生物制药和传统生产的治疗方法同样重要时，这将有利于最终释放测试。