摘 要：目的 制备白藜芦醇**（BTM）脂质体，对其质量特性进行评价，并考察脂质体对BTM的增溶作用。方法 采用薄膜分散法制备BTM脂质体，以包封率为评价指标，通过正交设计优化**工艺，微柱离心法测定其包封率，观察其形态、粒径及稳定性，并考察其对BTM的增溶作用。结果 优化的*佳**工艺：**与磷脂质量比为1∶20，*与磷脂比为1∶4，水化介质为5%*；按该**制备的脂质体包封率达（86.4±2.2）%；与游离BTM相比，BTM脂质体在水中的溶解度增大了1 012多倍。结论 采用*佳**制备得到的BTM脂质体包封率较高，形态和粒径较均匀，脂质体可以较好地提高BTM的溶解度。
关键词：白藜芦醇**；薄膜分散法；微柱离心法；包封率；正交设计
白藜芦醇**（3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene，BTM）是白藜芦醇的全甲基化衍生物，具有明显的抗新血管生成、抗有丝分裂作用，可以引起微管分解和微管蛋白解聚，用于抗肿瘤**。此外，BTM具有抗过敏、保护胃粘膜损伤以及抗衰老作用[1-3]。但是BTM难溶于水，光照下易发生异构化并降解，使其应用受到限制[4]。脂质体可以增加难溶性的**的溶解性，提高光不稳定性**的光稳定性[5-6]。本实验将BTM制备成脂质体，对其**工艺和质量特性进行评价，并考察脂质体对BTM的增溶作用。
1 仪器与材料
LC20A—DAD高效液相色谱仪（日本岛津），N—1100 旋转蒸发仪（东京理化器械公司），Digital sonifier S—450D超声波细胞粉碎机（美国BRANSON Sonifier），Nano—ZS90激光散射粒径仪（英国Malvern公司），Sirion 200场发射扫描电镜（荷兰FEI公司）。BTM对照品（质量分数99.2%，中南大学化学化工学院提供），BTM样品（中南大学化学化工学院提供），*（S100，德国Lipoid公司），*（天津博迪化工有限公司），葡聚糖凝胶G-50（北京瑞达恒辉科技发展有限公司），乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 BTM脂质体的制备
采用薄膜分散法[7-8]。精密称取适量磷脂、*、BTM于茄形瓶中，加入10 mL氯仿溶解后，旋转蒸发除去氯仿，使形成均匀透明的薄膜，加入5%*溶液15 mL，45 ℃水浴下水化4 h，使薄膜溶胀充分水合*，得乳白色混悬液；探头超声2 min，0.45 μm微孔滤膜挤出，即得BTM脂质体。
2.2 BTM定量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（75∶25），柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min，检测波长318 nm，进样量20 μL。
2.2.2 专属性试验 分别取空白脂质体、BTM乙腈溶液、BTM脂质体各0.2 mL，甲醇破乳并稀释*5 mL，按“2.2.1”色谱条件进样测定。结果表明，在此色谱条件下，脂质体辅料对BTM定量测定无干扰。
2.2.3 线性关系考察 精密称取BTM对照品10.0 mg于50 mL量瓶中，加乙腈溶解稀释*刻度，得质量浓度为200.0 μg/mL的BTM储备液。精密量取上述储备液适量，乙腈稀释成质量浓度分别为0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL的系列溶液，按“2.2.1”色谱条件进样分析，以色谱峰峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程A＝134 298.1 C－588.8，r＝0.999 9，表明BTM在0.1～32.0 μg/mL线性关系良好。
2.2.4 精密度试验 分别配制质量浓度为1.0、8.0、32.0 μg/mL的BTM乙腈溶液各5份，按“2.2.1”色谱条件测定，计算日内精密度和日间精密度。日内精密度RSD分别为0.27%、0.43%、0.19%，日间精密度RSD分别为1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 稳定性试验 取BTM脂质体混悬液适量，加甲醇稀释*质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件，在0、2、4、6、8、12 h分别测定BTM的峰面积，计算其RSD分别为1.38%、1.06%、0.59%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.6 重复性试验 取BTM脂质体混悬液适量，加甲醇稀释*浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件，连续测定5次，其质量浓度基本无变化，RSD分别为0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率试验 精密吸取0.2 mL空白脂质体于5 mL量瓶中，分别加入25、200、400 μL质量浓度为200.0 μg/mL的BTM乙腈储备液，加入甲醇破乳并稀释*刻度，重复3次，得质量浓度分别为1.0、8.0、16.0 μg/mL的样品溶液，分别进样测定，计算回收率。3种质量浓度的回收率分别为101.3%、99.3%、99.6%，RSD分别为0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱离心法[9-11]测定BTM脂质体的包封率
2.3.1 微型凝胶柱的制备 称取葡聚糖凝胶G-50 1.0 g于适量蒸馏水中，浸泡24 h，沸水浴煮沸20 min，使葡聚糖充分溶胀并除去气泡。静置冷却后，装填于2.5 mL注射器（底部填有适量脱脂棉）中，于离心机中3 000 r/min离心5 min，备用。
2.3.2 洗脱曲线的考察 精密吸取BTM脂质体混悬液0.2 mL，加于微柱的顶部，2 000 r/min离心3 min，收集洗脱液；再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水，2 000 r/min离心3 min，收集洗脱液；重复以上操作。从第12管开始更换洗脱液，用乙醇-水（3∶2）混合溶剂代替蒸馏水作为洗脱液，操作同上，继续收集10管洗脱液。所收集的洗脱液用甲醇破乳并稀释定容*5 mL。按“2.2.1”色谱条件进样分析，测定A B C 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
BTM质量浓度，以洗脱管号为横坐标，BTM质量浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线，结果见图2。可知脂质体在前8管基本洗脱*，BTM游离**则在第13管以后被缓慢洗脱，可见葡聚糖G-50微型凝胶柱可较好地分离脂质体与BTM游离**。该方法可用于BTM脂质体包封率的测定。
2.3.3 包封率的测定 精密量取BTM脂质体混悬液0.2 mL于微柱中，2 000 r/min离心3 min，收集洗脱液；再于柱顶部加入0.2 mL蒸馏水，2 000 r/min离心3 min，收集洗脱液；重复以上操作。合并1～8管洗脱液，甲醇稀释破乳后定容*5 mL，按“2.2.1”色谱条件进样分析，测定BTM质量浓度，记为C脂；另取BTM脂质体混悬液0.2 mL，加入甲醇超声破乳，破乳后甲醇定容*5 mL，按“2.2.1”色谱条件进样分析，测定BTM质量浓度，记为C总，计算包封率。包封率＝C脂/ C总C脂为包封于脂质体中的**质量浓度，C总为脂质体混悬液
中**的总质量浓度
2.4 单因素考察
2.4.1 药脂比对包封率的影响 固定*与磷脂的比为1∶3、水化介质为5%*、水浴温度45 ℃、水化时间4 h，选取BTM与磷脂的质量比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制备脂质体，测定包封率分别为46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。结果表明，药脂比在1∶10以下时包封率可达70%以上。
2.4.2 膜材比对包封率的影响 固定药脂比为1∶20、水化介质为5%*、水浴温度45 ℃、水化时间4 h，选取*与磷脂的比分别为1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制备脂质体，测定包封率分别为68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。结果表明脂质体的包封率随着*嵌入量的增加呈现先增加后减少的趋势。*对于脂质体起着膜流动性调节剂的作用，能适当提高**包封率和稳定性。但当*的量过大时，与脂溶性**BTM竞争磷脂双分子层位置，导致包封率下降。
2.4.3 水化介质的种类对包封率的影响 固定*与磷脂的比为1∶3、药脂比为1∶20、水浴温度45 ℃、水化时间4 h，选取水化介质分别为5%*、0.01 mol/L PBS、蒸馏水制备脂质体，测定包封率分别为78.2%、69.4%、72.7%。结果表明，水化介质为5%*时，脂质体的包封率*佳。
2.5 正交设计优化**
在文献资料[12]及单因素考察试验基础上，以包封率为指标，选择**与磷脂质量比（A）、*与磷脂比（B）、水化介质的种类（C）为考察因素，每个因素各取3个水平，进行正交设计，选用L9(34) 正交表安排试验，制备脂质体，测定包封率。。由正交试验结果分析可知，影响脂质体包封率的因素顺序为C＞A＞B，*佳**为A3B2C1，即**与磷脂比为1∶20，*与磷脂比为1∶4，水化介质为5%*。
2.6 *佳**工艺的验证
按上述筛选得到的*佳**，制备3批BTM脂质体混悬液（约相当于BTM 0.33 mg/mL），测定包封率分别为88.7%、84.3%、86.2%。3次验证试验的结果基本一致，说明所确定的优化**合理可行，重现性良好。
2.7 BTM脂质体形态
取*佳**制备的BTM脂质体适量，用超纯水稀释100倍，以扫描电镜观察脂质体形态。可见脂质体形态圆整，多为球形及类球形粒子，大小较均一。
2.8 粒径和Zeta电位的测定取*佳**制备的BTM脂质体适量，适当稀释后，用激光散射粒径仪测定脂质体的平均粒径和Zeta电位。脂质体的平均粒径为（183.6±2.1）nm，PDI为0.265±0.006，Zeta电位为（−15.3±1.2）mV。
2.9 初步稳定性考察
取*佳**制备的BTM脂质体3批，置于（4±1）℃冰箱中，于3、5、10 d取样，分别考察外观、粒径、Zeta电位和包封率的变化。结果BTM脂质体在4 ℃条件下放置10 d后，外观没有发生明可以看出，低温放置10 d，脂质体的外观、粒径及Zeta电位没有发生明显的变化，包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取过量的BTM原料药置于具塞试管中，加入超纯水，涡旋使分散均匀，于（25±1）℃的恒温振荡器中48 h，平衡后取样，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.2.1”下色谱条件进样分析，测得BTM在纯水中的饱和溶解度为0.32 μg/mL。取适量BTM脂质体于西林瓶中，加入10%蔗糖溶液作为冻干保护剂，冷冻干燥，得到冻干脂质体。取过量冻干粉于纯化水中，振摇复溶使分散均匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，加入甲醇破乳后，按“2.2.1”下色谱条件进样分析，测得BTM脂质体中**的饱和溶解度为324.2 μg/mL。BTM脂质体较其原料药在水中的饱和溶解度提高了1 012多倍，表明脂质体对BTM有较好的增溶作用。
3 讨论
BTM难溶于水，为脂溶性**。薄膜分散法简单易行，适合于脂溶性**脂质体的制备。本实验采用该法制备BTM脂质体，通过正交实验筛选*佳组成。制备过程中，成膜和水化是影响脂质体包0.1 1 10 100 1 000 粒径/ nm −200 −100 0 100 200Zeta电位/ mV 封率与粒径的关键步骤。成膜太厚、水化不*，制得的脂质体粒径偏大，放置易聚集，影响脂质体的稳定性；成膜不均匀，导致**未能很好地嵌入脂质体双分子层中，影响脂质体的包封率。脂质体包封率的测定方法通常有凝胶柱层析法、透析法、超速离心法、微柱离心法等[9-11,13]。凝胶柱层析法消耗时间长，且不易控制洗脱液的体积流量；透析法消耗时间也较长；超速离心法要求较高离心力才能将脂质体和游离**分离。微柱离心法是一种快速、简便地分离脂质体中游离**的方法，其优点是脂质体混悬液几乎没有被稀释，可以避免脂质体的渗漏。本实验采用微柱离心法测定BTM脂质体的包封率，脂质体与游离**分离效果好，方法简便，重复性好。采用*佳**制备的3批脂质体，包封率较高，粒径分布均匀，重现性良好，并且可以显著提高BTM的溶解度。放置10 d后，外观和粒径均未发生明显的变化，但包封率略有降低，推测**可能出现渗漏。将脂质体冻干，可以显著降低磷脂的水解和氧化速率，提高脂质体的稳定性[14]，实验拟进一步考察BTM冻干脂质体贮存稳定性。
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