奥林巴斯显微镜倾斜照明的介绍

任何曾经以直接，明亮的光线检查硬币的人都会观察到，由于来自硬币表面的镜面反射，在这些照明条件下，硬币表面上的浮雕很难看到。另一方面，当入射光被布置为以低掠角对“硬币"进行“打击"时，一面产生的阴影效应和另一侧的亮度（更靠近光线）导致硬币的浮雕细节脱颖而出在三维清晰度。

当使用已知的倾斜照明（有时称为轴向照明）的经典技术检查微观样品时，产生了类似的外观。仅限于聚光镜光锥的单个方位角的直射光仅允许从一侧照射样品，如图1所示。净效果是从另外几乎看不见的无色样品中显露伪浮雕的细节。复合透射光学显微镜中的倾斜照明的典型配置如图1所示。在聚光透镜系统下面设置了一个不透明的光阻，其具有从显微镜的中心光轴移除的小狭缝（或扇形止挡）。来自光源的照明光线穿过狭缝，然后从离轴的单个方位角通过聚光透镜元件系统。然后，倾斜光线从一侧的高度特定的角度照射样品，并通过靠近光圈边缘（非常靠近透镜座）的前透镜元件进入显微镜物镜。聚焦的光线会聚在物镜后焦平面上，并被引导到显微镜中间像平面，通过目镜观察。并通过靠近光圈边缘的前透镜元件（非常靠近镜头座）进入显微镜物镜。聚焦的光线会聚在物镜后焦平面上，并被引导到显微镜中间像平面，通过目镜观察。并通过靠近光圈边缘的前透镜元件（非常靠近镜头座）进入显微镜物镜。聚焦的光线会聚在物镜后焦平面上，并被引导到显微镜中间像平面，通过目镜观察。

倾斜的照明已经使第零级被移动到刚好在物镜孔周边的位置（该效果可以用目镜望远镜或聚焦在物镜的后焦平面处的Bertrand透镜来观察）。倾斜照明的结果是将通过试样的光的零级从中心移动到物镜前透镜元件的一个周边。这种零级顺序向单一方向的移动使衍射光的一个或多个额外的更高级别被包括在物镜的后焦平面上并有助于图像的形成。只有在零级顺序（通常称为边带）的单一方面的衍射命令才被允许进入物镜，并且由于照明倾斜，另一方的衍生订单*错过了物镜。这个概念在图2中示出，利用射线轨迹和简单的透镜来表示显微镜物镜。

一般来说，透明的标本在具有平行的光束的透射明场显微镜中被照射，所得到的图像的可见性差，并且没有显着的对比度。发生这种情况是因为当两者在图像平面上重新组合时，由样本的每个细节衍射的光的总和是四分之一波长的异相，而直接光通过样本。然而，从每个样本点发出的衍射光在零级未衍射光的任一侧包含侧带（参见图2），其偏离四分之一波的位移具有确定的余量。如果防止衍射光的一个边带到达图像平面，在剩余边带和直射光之间将产生建构性和相消干涉，以在显微镜的中间像平面处产生可见图像。倾斜照明是实现图像形成过程所需的边带抑制的优良机理。

在图2中，上面的射线追踪系统识别出通过样本的轴向光线和用于标准亮场配置的显微镜光学系统的路径。衍射光的对称分量被允许进入物镜并产生与图像平面上的直接光分量无明显干涉（具有建设性或破坏性）的互补图形，导致具有差的对比度和可视性的图像。对于倾斜照明（图2中的较低光线轨迹系统），几个衍射分量边带不被物镜捕获，但是至少一个较高阶分量与零次顺序一起被允许（ 在图中的物镜后焦平面处不包括二阶边带（ D（-2））以增加图示的清晰度）。在图像平面上的干涉产生具有显着更多的对比度和可视性的样本的图像。在轴向和倾斜照明的物镜后焦平面处的衍射大值的外观也在图中示出。因为图像形成只需要两个大值，所以倾斜的照明将产生可见的图像。在轴向和倾斜照明的物镜后焦平面处的衍射大值的外观也在图中示出。因为图像形成只需要两个大值，所以倾斜的照明将产生可见的图像。在轴向和倾斜照明的物镜后焦平面处的衍射大值的外观也在图中示出。因为图像形成只需要两个大值，所以倾斜的照明将产生可见的图像。

倾斜照明能够解决使用常规亮场技术难以区分的非常精细的样本细节。当斜光线以与显微镜光轴成角度“ob"的方式撞击物镜前透镜时，聚光镜前透镜与物镜之间的介质折射率为n时，分辨率，照度波长（λ）和折射率可以描述为：

有些作者将术语n·sin（ob）与照明的数值孔径相等，但这是误导的，因为该方程并不意味着表示从所有方位发出的全锥光，而是限于由单轴方向的轴向照明。在样品细节如此精细的情况下，零级未衍射和一级衍射边带光被分开等于物镜孔径的距离，分辨能力是轴向透射照明观察到的两倍，并且由方程：

显微镜符合上述方程（使用倾斜照明时）所需的光学条件使得样品周期的细节受到物镜的分辨能力的限制。在许多情况下，利用明场照明解决的样本细节如此严重缺乏对比，它们几乎不可视化或成像。用倾斜照明观察样本的终结果通常是分辨率的提高（超过在具有闭合的聚光镜孔径光阑的明场照明中获得的），并且在图像中产生阴影的，浮雕的伪三维外观标本。

倾斜照明技术是成像各种未染色物体（如活细胞，晶体，硅藻和类似透明或半透明样品）的理想选择。然而，必须谨慎地查看和解释所得到的图像，因为来自一侧的衍射指令没有有助于图像形成。出现在图像中的潜在假结构可以严重限制斜光的有用性，以检查和定量描述以前未观察到的样本细节。当用斜照明观察样品时，应始终考虑这一事实。

从显微镜出现以来，为了提高标本的可见度而采用的倾斜照明所需的条件可以通过简单透射光学显微镜的各种技术来实现。也许的方法是偏移部分闭合的电容器虹膜光阑或光源的图像。在前几年，一些显微镜配备有具有可靠的孔径光阑的聚光镜（如图3所示;请注意，聚光镜的透镜系统不应从显微镜光轴的中心位移）。该设备被设计成允许整个虹膜在水平平面中偏离中心，使得关闭圆形隔膜开口将导致将零级移动到物镜后焦平面的周边。

实际上，利用部分闭合的电容器虹膜光阑技术来实现斜照明的困扰与那些妨碍明场观察的问题相似。结果是衍射环的分辨率和叠加的一般损失，其围绕并混淆了微小样品细节的解释。此外，贝克线和其他不正确焦点的样品区域产生的不良光学效应使图像复杂化。为了避免许多这些问题，已经利用耦合到视频对比度增强的大电容器数值孔径的倾斜照明的组合作为产生与微分干涉对比（DIC）显微镜观察到的光学薄片强烈相似的光学薄片的有效方法。

尽管倾斜照明可以通过使聚光镜孔径偏心来配置，但目前由显微镜制造商出售的大多数聚光镜没有这种能力。一种替代技术涉及钨丝灯丝从显微镜光轴的横向位移，如图4所示。图4（a）中的图示出了聚焦灯丝的图像，其已经通过调整灯具位于显微镜后面的灯塔。当扩散滤光片插入光路（图4（b））时，光线展开，以倾斜方式观察标本的正确方向的照明梯度填充聚光镜孔径。可以实现的灰色调，在大多数情况下，通过将灯丝图像放置在覆盖聚光镜孔径光阑的大约一半的位置（如图4所示）。然而，仔细调整灯丝位置和聚光镜孔径，与利用具有不同不透明度的扩散屏幕相结合，应允许显微镜显示出显着的纬度，以微调图像对比度的调制。

用于建立可变度的倾斜照明的更常用的替代方案是使用放置在聚光镜的下透镜元件和孔径光阑正下方的扇区挡块（图5）。许多显微镜配备有位于聚光镜底部附近的过滤器支架，为插入扇形止动件提供了理想的位置。图5中显示了几个扇区停止设计的图示。过去，显微镜制造商可以使用扇区挡块，但是今天越来越难以找到。然而，可以从不透明纸或纸板的一部分制造简单的止动件，并切割以适合过滤盘或胶带到聚光镜的下侧。

每个扇区停止具有阻挡光的部分（在图5中标记为停止）和仅允许倾斜光通过的区域（图5中的标记通过）并照亮样本。停止和通过部分的尺寸通常随着物镜倍率和数值孔径而变化，适当的尺寸确定主要是显微镜实验室实现平衡的实验努力。扇形止动件可以在过滤器支架内旋转，以便从各种角度照射样品，或者（更方便地）可以采用圆形旋转台将样品旋转360度以实现所需的倾斜照明效果。这些建议可以作为指导，

与常规亮场技术相比，倾斜照明可以显着提高样本对比度，如图6所示的数字图像所示。图6（a）中的样本是使用亮场照明成像的牛动脉细胞，其中调整了聚光镜孔径大对比度。很明显，样本几乎看不见，细节在明场照明中很难区分。相比之下，当使用放置在聚光镜孔附近的扇区挡块（图6（b））倾斜照射样本时，对比度显着增加，并且许多细胞细节，包括核和伪足的位置变得可见。这个特定的样本很难形象化，

图6（c）和6（d）所示的小鼠肾脏厚部分的图像稍微容易一些。在明场照明（图6（c））中，一些标本细节是可见的，但是具体特征难以区分，整体图像严重缺乏对比度。如图6（d）所示，利用扇形挡块对样品进行倾斜照射产生显着的对比度提高。在这个数字图像中，细小的标本细节变得明显，以前在明场照明中难以观察到。

当与暗场技术相比，其中样品从具有高度倾斜的光的所有方位照射时，不对称的倾斜照明产生其特征高度依赖于照明入射角的图像。通过倾斜照明产生的图像在垂直于入射照明方向的边缘可见的意义上是不对称的，而与该方向平行（或靠近）的那些不是。这个概念在图7中针对相对于入射的倾斜照明角度的不同取向的两个样本示出。图7（a）和7（b）中的样品由从铝酸镧薄单晶晶片获得的相同视野（但旋转90度）组成，通常用作高温超导陶瓷的外延薄膜沉积用基板的钙钛矿。在这些晶体中结合阻碍了融合的薄膜形成，并且可能对所得膜的性质产生不利影响。图7（a）中所示的数字图像描绘了当晶体以纵向双轴平行于倾斜入射光线取向时，由孪晶畴产生的伪浮雕。相反，当晶体（和双轴）旋转90度时，使其垂直于入射光线（图7（b）），所以孪晶畴变得容易明显。这表示在倾斜照明下观察到的纹理效应的样品取向限制的壮观展示。

当以几个取向角度的倾斜照明观察半透明山羊毛样品时，获得了类似但不显着的结果。当棒状发丝的长轴平行于入射的倾斜照明取向时（图7（c）），显示出头发纤维的中心部分和边缘的结构细节。当毛发纤维垂直于照明轴线定向时，这个细节不存在（图7（d）），并且在两个取向角度之间的纤维表观厚度上观察到显着的差异。与入射光照平行的光纤比垂直于光源的光线要厚得多。从而，

由倾斜照明技术提供的表观三维效果并不代表实际的样本几何形状或形貌，不应用于进行样本尺寸的测量。倾斜照明图像的真实值是在样本内的折射率或其他光程差的显示过渡，使得能够更清楚地了解形态和内部结构布置。该技术可以应用于在明场照明中几乎不可见或透明的各种材料，并且不能被染色或以其他方式进行化学或热处理以增强对比度。研究生物体和过程如体外受精，玻璃或丙烯酸纤维，化学结晶，

通过倾斜照明确定折射率

有时利用斜照度作为Becke线测试的替代方案，以确定样品的折射率是否高于或低于周围介质的折射率。如果样品安装在较低折射率的介质中，则由轴向照明产生的阴影将出现在与光进入样品的相反侧，反之亦然，如图8所示。对于所示的两个图在图8中，描绘了两个相等大小的倾斜光线以相同的入射角通过周围的介质进入样品。在左图所示的点A处，光线分布在样品的较大面积上，而不是点B处，使得样本上的点A附近的区域比B点附近的区域更暗。在这些条件下，当通过显微镜目镜（图8的左上部分的A'和B'）观察时，样品的一侧将出现阴影或比另一侧更暗。当样品折射率高于周围介质的折射率时，就是这种情况。

当样本的折射率低于周围介质的折射率（图8的右侧）时，出现相反的效果。在这种情况下，样本的阴影或较暗侧将位于靠近倾斜光扇区停止的一侧。当样品和周围介质具有相同的折射率时，样品将是透明的（或不可见的），并且对倾斜照明没有折射效应。该折射率确定技术的灵敏度高度依赖于聚光镜焦距，虹膜光阑位置以及扇区停止点的几何形状（如果使用）。一般来说，当聚光镜小心地聚焦并获得均匀的照明场时，获得的结果。

反射光中的倾斜照明

反射或入射光倾斜照明虽然在很大程度上被微分干涉对比和暗视场技术所取代，但通常可用于冶金领域的金属和其他标本的检查。发射和反射光倾斜照明的基本配置之间的比较如图9所示。图9（a）中的图示出了轴向（亮场），斜射和暗场透射照明的主要光轴。简单的镜头模拟显微镜物镜，黄色箭头表示以实现所需照明模式所必需的各个角度定向的假想光线。角度θ是物镜角度孔的一半。沿着显微镜光轴定向的光线代表轴向照明，而位于轴线和极限角度θ之间的光线被物镜前透镜捕捉并形成倾斜照明。具有大于θ的入射斜角的光线不进入物镜并表示暗场照明。

图9（b）给出了反射光或外延照明的主光路。轴向（亮场）表面照射从垂直照明器到半反射镜在平行于显微镜光轴的方向上进行，其中它通过物镜系统反射到样本上。相比之下，倾斜外照射通过安装在物镜边缘的45度棱镜或反射镜反射到样品上。这些光线穿过物镜前透镜元件的周边并倾斜地撞击样本，但被反射，折射并衍射回物镜。如图9（a）中的情况，值θ表示所有的轴向和倾斜照明光线通过的二分之一物镜角孔径。具有较高角度的光线表示暗区外照射，其可以源于围绕物镜的外部光源或环形镜或透镜系统。在图9中，对于每种照明模式仅示出一个成像光线，但实际上这些光线将在所有方向上传播。

倾斜反射或外照射适用于检查金属，陶瓷，玻璃，聚合物和其他不透明样品表面上的周期性或线性结构。为获得效果，照明方位角应与观察结构纵向方向成90度角。该技术对于检查表面结构（特别是较低放大倍率）的浮雕非常有用，并且可用于通过确定阴影相对于照明方位的位置来证明样品表面上的结构是空腔还是突起。在反射倾斜照明中，应通过仪器可用的完整范围的倾斜角度和方位角检查样本，以获得分析。如果可能的话，应该采用旋转的圆形平台，并将样本旋转360度角以捕获所有必需的表面细节。应该注意的是，由于倾斜照明可以产生诸如彩色条纹和方向对比度之类的伪像，所以在尝试解释结果之前，显微镜应该将斜视图与在明场照明中获得的图像进行比较。

*的倾斜照明技术

与倾斜照明相关的几种显微镜技术，包括相差对比度和霍夫曼调制对比度，都利用显微镜的基本光学参数。具体地说，这些方法是基于聚光镜和物镜孔在主共轭平面上的事实，并且从聚光镜孔的每个点产生的照明光束以不同的角度（根据其空间频率）被衍射。通过这些技术利用的另一个基本概念是物镜后孔是显微镜的傅里叶光学平面。

在霍夫曼调制对比显微镜中，倾斜照明技术的复杂衍生物，聚光器孔配有狭缝掩模，其狭缝位于孔的边缘附近。物镜后焦平面包含称为调制器的第二互补掩模，其由具有不同透射度的三个区域组成。通过聚光镜狭缝的斜光照射到调制器的中心区域，并在该区域形成狭缝的图像。中心区域具有光密度，允许只有15％的光进入该区域通过调制器传输，而较暗（但较小）的区域仅透射1％的光。调制器板的大区域包括透明的第三区域，并基本上通过所有的入射光（减去由于反射和吸收而损失的光）。因此，物镜调制器板（掩模）衰减了被试样（通过15％透射率区域）而衍射的零级光，同时朝向黑色扇区衍射的光（1％透射）被阻挡。由样品远离掩模的暗部分衍射的光线不变，导致外观上与通过微分干涉对比度产生的影像相似的阴影投影图像，这增强了样品中的折射率梯度或光程差。因此，物镜调制器板（掩模）衰减了被试样（通过15％透射率区域）而衍射的零级光，同时朝向黑色扇区衍射的光（1％透射）被阻挡。由样品远离掩模的暗部分衍射的光通过不变，导致外观上与通过微分干涉对比产生的阴影投影图像相似，这增强了样品中的折射率梯度或光程差。因此，物镜调制器板（掩模）衰减了被试样（通过15％透射率区域）而衍射的零级光，同时朝向黑色扇区衍射的光（1％透射）被阻挡。由样品远离掩模的暗部分衍射的光线不变，导致外观上与通过微分干涉对比度产生的影像相似的阴影投影图像，这增强了样品中的折射率梯度或光程差。

称为单边带边缘增强或SSEE的相关技术利用在聚光镜前焦平面中的可调节半停止来封闭聚光镜孔径的一部分。位于物镜共轭后焦平面中的互补空间滤波器衰减并控制透射通过显微镜的未衍射光束的相移。背景（直接）波的相对于由样品散射和衍射到由半停止遮蔽的孔径区域中的光的相差的衰减程度和相移是可调节的。通过这种技术生成的图像在外观上与通过微分干涉方法获得的图像类似，但与DIC不同的单边带方法，不需要偏振光学元件夹住样品。可以调整系统以检测样品中极微小的相差，以及高分辨率下折射率的各向异性。该技术利用了两个衍射边带中只有一个必须被捕获以获得关于产生该特定衍射角的样本中的空间频率的信息的事实。如图10所示，单边带边缘增强对比度提供了高于其他流行的对比度生成模式提供的高空间频率调制传递函数。该技术利用了两个衍射边带中只有一个必须被捕获以获得关于产生该特定衍射角的样本中的空间频率的信息的事实。如图10所示，单边带边缘增强对比度提供了高于其他流行的对比度生成模式提供的高空间频率调制传递函数。该技术利用了两个衍射边带中只有一个必须被捕获以获得关于产生该特定衍射角的样本中的空间频率的信息的事实。如图10所示，单边带边缘增强对比度提供了高于其他流行的对比度生成模式提供的高空间频率调制传递函数。

结论

当显微镜物镜在其边缘照亮时发生的光学效应根据透镜质量，像差校正和样本特性而显着变化。当照明光束部分地落在物镜孔外面时，如在倾斜照明中那样，结果是相对于边带强度降低零级光强度，并且在物镜光阑的边缘处产生衍射图案。因此，照明锥体应限制在小于全部物镜孔径以避免衍射伪像（如干涉条纹）。聚光镜照明方法的仔细实验应确保在限制孔径下的均匀照明场。

与微分干涉和相差相比，倾斜照明有几个优点。样本中固有的双折射不会像DIC那样混淆倾斜的照明图像，而是在倾斜照明的定向阴影图像中清楚地观察到相差细节。一个很好的例子是脊椎动物轴突，由于它们的高度双折射髓鞘，在DIC中产生过度的对比度，因此它们更倾斜地成像。此外，倾斜照明的设备成本明显低于DIC，相差或霍夫曼调制，因为的要求是配置好的明场显微镜。在某些情况下，倾斜照明技术使显微镜能够比DIC可能更深地成像到组织层中。后，解决方案不会因为可以实现明亮的场景而受到影响，对比度可以大大提高。