在透射光显微镜，标本质量并不总是借给自己容易观察和图像记录在简单明成像模式出色的对比度。 处理固有的低对比度的标本，如细菌不染，超薄组织切片，贴壁活细胞的研究，依靠专门的对比度增强技术，以协助这些成像几乎透明的样品。 在通过在样品和背景之间的亮度分布差异非常小的变化样品检验结果未染色标本，光吸收差的过程。 当背景是明亮的，人眼需要至少10至20%的局部强度的波动，以便能够识别标本的信息。 不幸的是，这种电平调制的很少见到有透明的标本，其通常呈现几乎看不见针对类似强度的背景。 术语透射光 ，在光学显微镜中使用时，是指其中光从照明源传递试样的相反侧的物镜(因此，照明是通过样品传送的 )的任何成像模态。 在本节描述的对比度增强技术代表了多种样品制备方法，以及产生这对于观察和成像有用强度的变化的光学技巧。
方法能够增强对比度包括微分干涉对比（DIC），偏振光，相位相反，霍夫曼调制对比，以及暗场显微镜(实施例在图1中示出)。 几个这些技术是由光原产于成像较厚植物和动物组织，当从焦平面去除区域的限制，而偏振光需要双折射率(通常不存在于动物细胞中一个显著度)以产生对比。
图1所示是各种被在透射光显微镜通常使用流行的对比度增强技术。 图1中的薄的*分(一)揭示了用曙红和苏木精以产生明场成像模式下的色彩对比度的人基底细胞癌。 图1(b)表示活HeLa细胞与相衬成像的塑料的组织培养容器中。 安装在水性介质中的中国麂细胞的固定培养都在图1的(c)微分干涉对比图像呈现。 在食盐水溶液沐浴小鼠心脏肌肉的新鲜组织切片显示在图1(D)面板，其中使用霍夫曼调制(或ZEISS VAREL)相反，斜光技术产生的对比度。 与暗场照明观察辉煌明亮式暗对比度使用Obelia水螅标本图1(e)所示。 后，兔骨骼肌纤维(图1(F))是生物样本是双折射的，并且表现出在偏振光对比度之间。
明场照明
其中的所有形式的光学显微镜用于过去三个世纪的首要和喜欢的技术，明照明依赖于光的吸收，折射率，或颜色变化产生的反差。 作为光穿过样品，即改变区域的方向，速度和/或波前的光谱产生时的光线被聚集和由物镜聚焦的光的差距(对比度)。 在明场系统分辨率取决于物镜和聚光镜数值孔径，和一个浸没介质上需要的试样(对数值孔径的组合超过2.3的值)的两侧。 数码相机提供的宽动态范围和捕获存在于明场图象中的信息所需的空间分辨率。 另外，背景减除算法，使用平均以在光路中无试样采取帧，显着地增加对比度。
简单明成像，以适当调整对柯勒照明显微镜，提供的关于细胞轮廓，核的位置，并在未染色标本较大囊泡的位置信息的程度有限。 对比在明成像取决于光的吸收，折射率或色差。 作为光通过试样改变方向，速度或成像波前的光谱特性的光的差距(对比度)的开发。 该技术是用可见光吸收染料染色的标本更为有用(如曙红和苏木;参见图1(a))。 然而，普遍缺乏检查未染色标本时，在明模式的对比度使得这种技术相对无用的活细胞结构的认真调查。
相差
首先由荷兰人弗里茨·泽尔尼克在1934年描述，相衬赢得了发现者的诺贝尔物理学奖于1953年，而在活细胞革命性基础生物医学研究。 该技术是理想的薄未染色标本(如玻璃上培养的细胞)，这是大约为5至10微米厚的核以上，但低于在外围厚微米。 这样试样几乎没有表现出任何的光吸收在光谱的可见部分和在明场和暗场照明人眼不能检测到它们。 相衬(如在图1(b)所示)采用一个光学机构在相转化的微小变化成振幅相应的变化，这可以看作在图像对比度的差别。 显微镜必须配备含有环形或匹配于一组含有相环(设计PH）中的后侧焦点面物镜的一系列的环的一个专门聚光镜(相差物镜也可以与荧光使用，但有轻微的减少传输)。 相衬是观察或培养成像活细胞时，增加对比度的好方法，但通常会导致周围的边缘特征的轮廓晕。 这些光环是光的文物，往往减少的边界细节的可见度。 该技术是没有用的厚标本(如植物和动物组织切片)，因为相移发生扭曲图像细节的焦平面删除的区域。 此外，漂浮物和其他外的焦点相对象与盖玻片成像粘附细胞干扰。
如图2中所示，细胞的折射率和其周围的水溶液之间和细胞质(图2(b))和细胞核(图2(c))的之间的细胞内的存在非常小的差异。 无显著折射率差发生在盖玻片和周围介质(图2(a))。 相衬使得这些微小差异通过使用光学操纵，例如，它它们翻译成可被目视观察并记录在强度差可见。 在这种情况下，所用的光学效应包括光的波前通过试样的不同部分行进之间的相位关系的转变。 期间通过细胞核，细胞质，或水的旅途中，光波通过小度错开(延迟)，因为这些媒体具有稍微不同的折射率(的介质的折射率越高，较小的速度或光速在培养基中)。 其结果，已通过一个细胞核传递光波滞后于光波只有通过水的后面(比较图2(a)和图2的(c))。 滞后的量被称为相移。 其进入检体之前，海浪仍在相(盖玻片下方波前)，但是这是不再时，他们已通过具有不同折射率的各种材料传递的情况。 相移的量取决于波都通过它们的路径通过什么媒体(折射率)，并且路径是通过这些媒体多久。 人眼不能看到的显微镜图像，这些相移，它仅能够不同的强度和颜色来区分。 因此，相衬技术使用光学技巧来转化相移为灰度值。
在相差显微镜构造中，聚光镜孔径光阑被照亮通过在光方式的中空锥体聚光镜光学部件的检体的相位停止(其尺寸取决于物镜和聚光镜数值孔径)所取代，如在图中所示图3(a)。 这些波前输入的物镜和在后焦平面在创建阶段停止的图像(物镜瞳孔)。 物镜后焦平面内的是一期环或片，不仅衰减从聚光镜的阶段停止明亮，直接发出的光，而且还增加了一个恒定的相移这个光。 如果样品中含有亚结构具有混合的折射率，这些实体引导从直接波到新路径的光(图3中红色虚线(一))。 由检体衍射波前(实际上，包含结构信息的那些)将不会穿过物镜的相位环，这意味着它们将不会被衰减或延迟。 所有的波前的终重新组合，以形成由管透镜的中间图像。
该已全部在试样通过细节阻碍不同程度的波前叠加在移和衰减波前在那里放大或衰减彼此(取决于相)的中间图像中，形成在所观察到的后的相位对比图像目镜。 中间图像中这些干扰过程产生具有在试样的折射率(和/或厚度)的变化的各种结构的亮区和暗区。 对比度是通过选择正确的相位差和衰减值，这是在物镜孔径的相位环的光学特性的函数产生。
相衬成像的主要神器出现在周围的标本边界光线明亮的光晕 。 光晕发生在相差显微镜因为位于物镜相位片的环形相位延迟(和中性密度)环还发送从试样小程度的衍射光的(它不限于单独通过环绕波)。 的问题是由以下事实非衍射光(零阶)的宽度包围波前投影到由聚光环形相位片比所述相位差板环的实际宽度小复杂。 厚厚的标本，常常表现出高度重叠的结构，产生严重的晕文物。 因此，相衬]是只推荐用于非常薄的试样，其中的几个结构不是物理躺在彼此之上的方法。 在厚厚的标本，细节可以混合成一个形象，说到底，不再是清晰可辨。
相衬要求，配备瞳孔或后孔附近的相环的特殊物镜。 它们很容易由绿色碑文，它表示相应的聚光镜相光阑的大小来识别：PH1，Ph2 ，或Ph3的。 如果你持有这样的物镜对光和看到从螺纹端瞳孔，您将可以看到灰色/透明相环。 聚光镜需要一个，两个或三个阶段停止时，根据附加到所述显微镜物镜转换的相衬物镜。 与数值孔径所需环直径增大(高孔所需要的大直径（PH3），例如0.9在空气或1.3与浸油)。 三个尺寸可供与足以为所有物镜(如图3(b))。 如果您使用的只有一个环的大小相衬，用于聚光镜容易附着和可拆卸的外挂站就足够了。 有几个坐骑炮塔盘面较为方便，因为它包含了所有的三相站，使成像过程非常快的转换。 附加开口可用于必要在明照明和暗视场光阑的孔径光圈。
它们已被安装在聚光镜之后，使得在物镜光瞳相位光阑的图像与相环中的光束路径的位置正好对应的相位站必须居中(见图4的(c))。 定心是使用两个小扳手(或螺丝起子，取决于显微镜模型)聚光镜的转台盘上进行的。 如果你想成为特别精确，使用定心望远镜观察物镜后孔作出这些调整，如图4所示。这个小配件看起来像一个目镜和插入观察筒到位目镜的说明。 当望远镜被聚焦在物镜的光瞳(后孔)，相位停止的位置可以清楚地观察到。 再次，考虑物镜瞳孔并把聚光镜阶段停止的鲜明形象重合到与物镜相环。 这在图4在图4清楚地示出(a)和4(b)所示，相停止不与物镜相位板对准，而停止与相位板是在图4的(c)完美的一致性。
在相衬一个标本的图象可以通过在物镜的相位环的仔细选择适当地选择直接(非衍射)光束的相位差的影响。根据所选择的相位差值，具有比其周围高的折射率的对象出现或者更亮或比其周围更暗。 这也被称为正或负相衬。 在现代显微镜，正相对比标准，在对象的暗设有它们的折射率增加。 效果模拟在更高的折射率产生高对比度特性的区域吸收到观察者的眼睛。 这种印象被认为是的，特别是与在水性介质中的细胞和组织，因为细胞核和细胞器，例如，出现比细胞质暗。 对于一些应用，如观察的精子细胞，负相位对比度可能产生更多的标本细节比传统的正相位对比度。
微分干涉对比(DIC)
微分干涉对比显微镜（DIC;图1(c))的要求平面偏振光和额外的光剪切(诺马斯基)棱镜夸大试样厚度梯度和折射率的微小差异。 脂质双层，例如，产生由于在小区的水相和脂质相之间的折射率的差在DIC优异的对比度。 此外，在相对平坦的粘附哺乳动物和植物细胞，包括质膜，细胞核，液泡，线粒体和应力纤维，这通常产生显著梯度小区边界，容易并发DIC成像。 在植物组织中，双折射细胞壁降低DIC对比度在有限的程度，但正确对准的系统应允许核和液泡膜，一些线粒体，叶绿体，并在表皮细胞稠染色体可视化。 微分干涉反差成像厚植物和动物组织，因为，除了增加的对比度，DIC展品宽孔口景深减小，创建厚的样品的薄光学部分的一个重要的技术。 这种效果也是成像粘附细胞，以减少从漂浮物在培养基中所产生的模糊是有利的。
微分干涉对比光学系统是基于偏振光对比度技术尽可能多使用的组件有关。 DIC对于现代透射光显微镜比在反射光不同的，因为两个双折射棱镜被使用(参见图6)，以及检体的光程差由折射率差的积求出(试样和其周围的介质之间的)和光路上的两个点之间通过的光束穿过的厚度(几何距离)(图5)。 在微分干涉显微镜产生的图像的特征在于*的阴影播送的外观，就好像它们是从一个高度倾斜光源从单一方位角始发照亮。 不幸的是，这种效果，这往往会呈现在伪三维浮雕检体(图6(d))的，经常被不知情显微镜假定为实际地形结构的一个指标。
图6示出了类似于偏振透射光的微分干涉对比光束路径。 在DIC(相对于偏振光)，两个双折射棱镜(图6的(b))被插入到光列车，一个在聚光镜和靠近物镜光瞳的第二个。 聚光镜棱镜执行先前直线偏振光(图6(c))的一个矢量分解成垂直地偏振的两个彼此振动方向，并且横向以这样的方式移动，这些分光束的波前的一个小的横向位移发生，其中厚度或折射率的区域而变化。 如果这两个部分光束现在通过*相同的结构，会发生在试样没有进一步程差(图5(a)和图5(c))的。 然而，如果两个分光束看到稍微不同的条件下，他们每个人将经历伴随它上的剩余行程的中间像平面(图5(b))的一个稍有差异的路径长度。
如所讨论的，分割DIC光束进入和通过，他们的波径是根据试样的厚度变化，山坡，和折射率altered试样。 这些变化会引起在通过的任何标本细节紧贴在一起领域两个光束的波路径变化。 当平行光束进入物镜，它们被集中在那里输入的第二DIC棱镜，结合了两个光束在一个限定的距离，棱镜本身以外的后侧焦点面的上方。 此删除剪切(波之间的距离)和梁对之间的原始路径差。 如在穿过试样的结果，平行光束的路径是相同的长度(光程差)，用于不同样品的区域的不。
为了使光束干涉，不同的路径长度的光束的振动必须进入同一平面及轴。 这是通过将上部DIC光束组合棱镜上方的第二偏振器(分析器)来完成。 光然后朝着在那里可以观察到的强度和颜色差异的目镜前进。 设计结果中的检体细节的一侧出现明亮的(或可能有颜色)，而另一侧看起来更暗(或其它颜色)。 此阴影效果赋予所述伪三维外观被上述检体。 相比，相差显微镜有在DIC显微镜许多优点。 与DIC，能够更充分地利用该系统的数值孔径，并以提供光学染色(色)。 DIC还允许显微镜来实现出色的分辨率。 充满物镜孔径的使用使得该显微镜专注于一个厚的样品的薄平面部分，而不从平面的上方或下方混淆图像。 恼人的光晕，在相衬经常遇到，是在DIC图像不存在，以及适当的消色差和萤石物镜可以用于这项工作。 重要的是要记住，是很重要的，然而，由于DIC是基于偏振光原理，高双折射标本或那些嵌在双折射材料不应DIC下观察。
霍夫曼调制和VAREL对比
比喻通常被称为“穷人的DIC”，霍夫曼调制对比度（HMC）是一个斜照明技术，增强了通过检测光学相位梯度的活细胞和组织的对比(见图1(D))。 基本显微镜配置包括光学振幅空间滤波器，称为调制器，其被插入到物镜的后侧焦点面。 光强度通过调制器的上方和下方的平均值，根据定义，然后所述待调制而变化。 耦合到物镜调制器是放置在聚光镜前焦平面引向试样偏斜照明离轴狭缝孔。 不像在相差显微镜的相位板，所述霍夫曼调制器的设计不改变穿过的光的相位; 相反，它影响的主要零阶极大产生对比。 霍夫曼调制对比不被使用在光学路径双折射材料(如塑料陪替氏培养皿)的阻碍，因此，该技术是用于检查在与聚合材料构成的容器的标本更为有用。 在下行路上，HMC产生了许多渲染技术，一定程度上比相衬或DIC对盖玻片活细胞成像用处不大的光学构件。
新开发的对比技术，其中相差与倾斜单侧照明(类似于HMC)相结合，已经开发了活细胞在培养容器中的检查。 形如环形扇区的附加停止使用在照明侧，允许单边倾斜照明。 三个照明模式，单侧暗场，VAREL(可变浮雕)对比度和倾斜明(类似于偏斜照明或HMC)由来自外部的移位停止在径向方向上的内侧设置(见图7)和一个段匹配环形移入位置。 该缝隙指示源照明穿过高吸收对物镜孔的外围，其通过依赖于外圈的密度的量抑制其强度的第二环。 光的衍射级通过物镜而不受VAREL环被抑制。 如果要发生变化的源照明被抑制的程度也可以操纵该狭缝的位置。
取向是容易实现和由于狭缝的同心性维护。 此外，因为在物镜的VAREL环位置的，VAREL和相衬环可在相同的物镜相结合。 这使得在培养容器中的成像单元的一个非常低的价格的方法。 成像在传统和常规组织培养应用的问题都可以用这种方法来解决，这是活的对象(显微)的检查成功选项，以及具有不同光学厚度的范围内的结构很容易与VAREL成像。 即使有一个弯曲的底培养容器允许产生一个有用的图像。 相衬独自有时会失败，在这种情况下，因为一个弯曲的腔底座就像一个镜头，损害相环的叠加。 滑块包括两个所提及的扇区，以允许从左侧或右侧进行照明，根据需要。 这使得有可能对比电池甚至邻近在微量滴定板中的孔的边缘。
暗场照明
周围的暗视野显微镜的方法，虽然被广泛用于成像整个19世纪和20世纪透明标本，在使用仅限于物理隔离的细胞和生物体(如图1给出(E))。 在该技术中，聚光镜引导光锥到在高方位角检体，使得阶波前不直接进入物镜前透镜元件。 光穿过样品被衍射，反射，和/或通过光学不连续性(如细胞膜，细胞核和内部细胞器)使这些微弱光线进入物镜折射。 然后，标本可以看作对一个原本黑色的背景明亮的物体。 不幸的是，由从焦平面除去对象散射光也向图像，从而降低对比度和模糊检体的细节。 这个伪影的事实，灰尘和碎屑在成像室也显著向所得图像有助于复杂。 此外，薄的粘附细胞经常遭受非常微弱的信号，而厚植物和动物组织重定向太多的光到物镜路径，减少了技术的有效性。
近，结合荧光显微镜一起使用时在发送暗场显微术的新兴趣已经出现由于它的优点。 暗视野显微术是一种专门的照明技术，该技术利用了偏斜照明中，如上所述，以提高在该不能很好在正常明照明条件成像标本的对比度。 人工黑暗的背景中在聚光镜使用的环形止显微镜创建(见图8)。 虽然聚光镜光学然后照射样品，他们这样做与光的通过在所有方位角在其角度检体传递的中空倒锥形，使得仅光与标本特征的交互是能够进入显微镜物镜以形成叠加到一个黑暗的背景标本的鲜明形象。 创造高角，它是必要的物镜孔径为比照明光锥的内孔径较小(见图8的(a))。 然而，具有集成可变光圈的物镜还提供快门出即使它落入物镜的孔径锥间接光(如在图8(b)所示)。 这允许用于暗场照明采用非常高的孔。 暗视野显微镜是生物学和医学研究的工具。 它可以以高倍率有效地用于图像活的细菌，或在低倍率查看和图像的细胞，组织和整个支架。
偏振光
偏振光显微镜是一个对比增强技术，显着地改善与其它技术相比，如明场和暗场照明，相差，微分干涉对比，荧光，和霍夫曼调制对比时与双折射材料获得的图像的质量。 偏光显微镜具有高度的敏感性，并且可用于针对广泛的各向异性标本的定性和定量研究。 定性偏光显微镜颇为流行的做法，但是，偏光镜的数量方面，这是在晶体主要应用，代表了更棘手的问题是主要由矿物学家，地质学家，化学家和。 过在高度敏感的偏振光显微镜在过去几年取得了稳步的进展已经允许生物学家审查的几个各向异性亚细胞集的双折射性质。
偏振光显微镜(图1(f))的通过查看插入到聚光镜之前的光列车和物镜后交叉偏振元件之间的样品进行的。具有双折射特性，如植物细胞壁，淀粉颗粒，和有丝分裂纺锤体，以及肌肉组织中的细胞，内组件旋转光偏振面，在暗背景上显示鲜艳。 在图1(F)中所示的兔肌肉组织是施加到活组织观察偏光显微镜的一个例子。 注意，这种技术是由双折射的发生在活细胞和组织的限制，并且还没有被充分开发。 如上所述，微分干涉对比操作通过将一对匹配的相对的交叉偏振器之间诺马斯基棱镜，使装备DIC观察任何显微镜还可以采用审查平面偏振光试样简单地通过从光路径除去棱镜。
有在偏振显微镜两枚偏光元件(参见图9)。 偏振器置于与固定在东 - 西方向其振动方位角的试样台下方。 注意大多数商业显微镜这些元素可通过360度旋转。 另一个极化(分析器)，这通常是与面向北南(但在一些显微镜再次转动)的振动方向对齐，置于物镜上方并可以移入和移出作为所需要的光路的。 当两个偏振器和分析器被插入到光路中，其振动方位角被定位成直角彼此。 在这种结构中，偏振器和分析器被划掉，没有光穿过光学系统和黑暗的背景中存在的目镜一个(图9的(a))。 线性偏振光波被从振动方向在自然光线通行的统计混乱筛选出特权平面偏光片产生。 光(普通和特殊波)的两个正交分量在通过检体不同的速度行进，并且作为结果，观察不同的折射率，被称为双折射 (来自术语双重或双折射衍生)的现象。 双折射的定量度量等于所述波前折射率之间的数值差。 更快的波前首先出现从试样产生具有较慢波前的光程差。 分析器重组两个波前在相同的方向上行进，并在同一平面中振动的分量。 这种偏光元件确保两个波前必须在重组的大对比度时的相同的幅度。
为偏振光成像的适当的配置是相对容易实现的几乎任何显微镜。 聚光镜(靠近孔径光阑)下方偏振片确保样品与通过聚光镜直线偏振光的波前照射(参照图9的(a))。 分析器(第二偏振片)，其被定向以设置在90度到偏振片的角度的方位角，位于物镜的后面。 管透镜形成中间图像，这是通过目镜或到照相机成像平面投影。 如果没有检体放置在显微镜工作台上，现场通过目镜观察将保持*黑暗。 当照射时，许多标本转动偏振光的振动方向出由偏振片产生的平面。 这种标本主要由双折射材料，其中，折射率取决于入射光的振动方向。 这主要是与晶体，例如淀粉或矿物质(图9的(c))的情况下，但也会发生与纤维(图9(D))和聚合物。 如果这样的材料的交叉偏振器和分析器之间的偏振显微镜下观察，明亮的部分可以在图像中可以看出，因为光被部分地由分析仪发送。
偏振光显微镜的光学列车还可以包括被称为一个lambda或相位差板的辅助元件(图9(a)和图9(b))是，在定量分析时使用。 在偏振光，这拉姆达板转换成对比的颜色。 如在相衬，光程差引起的颜色，虽然这一次在试样偏振光和双折射材料。 产生的潜在客户通过干扰光线特定波长的消光路径差(只有某些颜色保持从白光和创造美丽，彩色照片)。 偏光显微镜提供的大约的范围内的样品的组合物和三维结构的信息的巨大的量。 在其范围内几乎是无限的，该技术可以揭示关于热历史以及其中试样形成期间经受的应变信息。 在制造和研究有价值，偏光显微镜是相对便宜和可访问的研究和质量控制工具，它可以为用户提供的任何其他技术不可用的信息。
