液氮罐冻存细胞的方法和步骤

　　细胞冻存是细胞生存的重要要领之一，使用冻存技能将细胞置于-196℃液氮中低温生存，可以使细胞临时离开生长状态而将其细胞特性生存起来，如许在必要的时间再苏醒细胞用于实行。并且适度地生存肯定量的细胞，可以防备因正在造就的细胞被污染或其他不测变乱而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

　　除此之外，还可以使用细胞冻存的来购置、寄赠、互换和运送某些细胞。 细胞冻存时向造就基中参加掩护剂——终浓度5%~15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点低落，加之在迟钝冻结条件下，细胞内水分透出，淘汰了冰晶形成，从而制止细胞毁伤。尺度冷冻速率开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加快，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

　　现在常用的掩护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

　　使用材料

　　仪器：液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等

　　试剂：0.25%酶、造就基、含掩护剂的造就基(即冻存液)

　　附：冻存液配制：造就基参加甘油或DSMO，使其终浓度达5-20%。掩护剂的种类和用量视差别细胞而差别。配好后4℃下生存。

　　操作步聚

　　1.消化细胞，将细胞悬液网络至离心管中。

　　2.1000rpm离心10分钟，弃上清液。

　　3.沉淀加含掩护液的造就，计数，调解至5106/ml左右。

　　4.将悬液分至冻存管中，每管1ml。

　　5.将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口肯定要严，不然苏醒时易出现爆裂。

　　6.贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

　　7.按下列次序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。

　　注意：操纵时应警惕，以免液氮冻伤。液氮定期查抄，随时增补，绝对不克不及挥发洁净，一样通常30立升的液氮能用1～1.5月。