一、试验目的。
 

　　1、掌握无菌操作技术。
 

　　2、掌握原代和传代细胞培养。
 

　　3、掌握细胞冷冻和复苏技术。
 

　　4、了解培养成纤维细胞的形态。
 

　　二、试验原理。
 

　　将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
 

　　细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
 

　　对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。
 

　　三、实验器材及药品。
 

　　器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO2培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。
 

　　药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓
 

　　冲液等。
 

　　四、实验操作。
 

　　1、消毒灭菌。
 

　　将实验所需用到的工具(如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等)集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
 

　　2、培养基的配制。
 

　　分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。
 

　　(1)、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。
 

　　(2)、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200µl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。
 

　　(3)、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。
 

　　(4)、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于36.5℃恒温CO2箱培养，瓶口少少拧的松一点。 4、传代培养。
 

　　(1)、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。
 

　　(2)、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200µl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。
 

　　(3)、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO2培养箱中培养。培养1—2天后于显微镜下观察细胞的形态。
 

　　5、细胞冷冻保存。
 

　　(1)、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200µl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集细胞。
 

　　(2)、冷冻。向离心管中加入一定量的培养液以及10%—20%的DMSO冷冻液，吹打混匀并转移到冷冻管中。先将冷冻管在4度冰箱中放置10min，再放在—70度的冰箱中冷冻过夜。
 

　　(3)、复苏。将冷冻的细胞取出来后，立刻放在40度水浴中，使其快速融化。并对融化的细胞 进行进一步的观察。
 

　　五、实验分析与讨论。
 

　　从本次实验的图片可以看出来，实验做得还算成功，细胞基本上没有被污染。在做的过程中一定要非常注意无菌操作，这是决定试验成功的关键因素。在做原代培养的时候，一定要将小鼠胚胎的组织块剪得够碎，确保在用胰酶消化后可以得到分离的单个细胞。在做传代培养时，要把握好胰酶的消化时间。冷冻复苏时，一定要按照步骤进行冷冻，遵循慢冻速溶的原则。