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公司新闻

今天来说说色谱柱的“沐浴”与“再生”之术

阅读:999发布时间:2019-12-26
  各位小伙伴了解月旭色谱柱的维护方法吗?总是有小伙伴用错了冲洗方式,在这里介绍一些反相色谱柱冲洗和再生的实用方法,希望不太了解的小伙伴们快来看一看。
 
  壹·反相色谱介绍
 
  迄今为止,反相色谱是高效液相色谱中使用广泛的技术,它能普及的原因是其能适用于绝大多数非极性化合物、弱极性化合物及离子化合物的分析。反相色谱中使用的固定相大多是天然存在的疏水基团,由于待测物与固定相之间相互作用的不同而被分离开来。
 
  贰·反相色谱柱是如何被污染的
 
  反相色谱柱中使用最多的就是硅胶基质色谱柱。硅胶基质的表面有许多残留的硅醇基,图1显示了硅醇基可能存在的多种形式。在弱酸性环境中,这些硅醇基能和特定的化合物和基质成分特别是碱性化合物发生相互作用,导致碱性化合物吸附于硅胶表面。同时,硅胶中残留的重金属离子会将酸性更强的物质引入到硅胶表面中。另外,硅胶也会与金属螯合物或清洁剂发生相互作用。
 
图1、硅醇基存在状态
 
  例如,像玉米油,高级芳香化合物和蜡这样的样品基质会粘附在反相填料表面并改变其性质,含有蛋白质成分的生物样品也会吸附在填料颗粒表面,即使采用样品前处理的方法来避免外来物质的污染以保护色谱柱,最终待测物的基质仍然会吸附在色谱柱表面。色谱柱在被污染后的色谱行为会不同于未被污染的色谱柱。
 
  通常样品基质中会含有一些与目标分析物无关的污染物。比如盐,酯类,脂肪族化合物,有机酸,疏水性蛋白和其他生物组分,这些都是可能与固定相发生相互作用的物质。与目标分析物相比,这些污染物的保留能力可能更强。一旦这些预料之外的污染物被检测器检测到,在色谱图上则表现为色谱峰分叉,基线波动甚至是负峰。
 
  如果污染物在色谱柱上的保留能力很强,流动相的洗脱能力不足以将这些污染物冲出来,那么在多次进样后,这些吸附在色谱柱上的污染物就会聚集。当污染物积累足够多时,它们就会像改性填料一样表现出相应的性质,目标分析物与这些污染物的相互作用会影响其原本的分离机制,导致保留时间波动和峰拖尾。如果污染物更多,则柱压可能升至很高的水平,甚至超过柱压上限。
 
  叁·冲洗反相色谱柱
 
  月旭色谱柱推荐正向使用,反向冲洗。
 
  由于绝大多数保留能力强的污染物通常位于色谱柱柱头端,因此反冲色谱柱可以大大缩短污染物离开色谱柱需经过的距离。月旭色谱柱两端所用筛板孔径一致,不会出现反冲时将填料冲出的问题。大多数现代不锈钢色谱柱是在比日常使用压力更高的压力条件下充填的,因此在反冲时柱床通常不会受到影响。
 
  对反相柱进行柱清洗的频率取决于强保留性物质进入到色谱柱的多少。由于反相色谱柱在表现出分离度下降或释放异常物质之前能够耐受较大程度的污染,因此用户通常等观察到色谱柱异常后才会进行冲洗,但是污染物的堆积会使清洗工作变得更为困难。基于这个原因,如果有的样品基质比较复杂,建议定期对色谱柱进行冲洗。对色谱柱冲洗的频率越高,所需的冲洗程序也就越简单。
 
  NO.1
 
  日常冲洗
 
NO.2
 
  异常冲洗
 
  (当色谱柱出现柱压升高、峰型异常、柱效下降、分离度下降)
 
肆·冲洗反相色谱柱的残留蛋白质
 
  如果污染物是生物类,比如血浆,血清,蛋白质和多肽在反相色谱柱上聚集,通常乙腈或甲醇这样的纯有机溶剂难以溶解这些污染物。然而,有机溶剂与缓冲盐、酸或者离子对试剂混合溶剂能冲洗掉生物类污染物。
 
  如果色谱柱被生物类样品污染,推荐使用乙腈:水:三氟yi酸 (50/50/0.1)为流动相,在做样流速下反向冲洗60倍柱体积,并在进样前用初始流动相对色谱柱进行平衡,那么色谱柱对生物类样品的分离能力就可以恢复。
 
  各位小伙伴如果想了解更多有关高效液相色谱柱的清洗与再生的相关信息,请咨询月旭当地销售人员垂询。



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