本文转自：药品质量研究本文转载自“药品质量研究”公众号，作者：Yvette-叶
样品、固定相(色谱柱)和流动相作为液相日常分析的三要素，与我们建立科学稳健的分析方法息息相关。日常遇到的各种分析问题，除硬件外，无外乎这三者。
从方法开发角度来说，从头设计，过程中解决好这三者之间的关系，一般都能设计一套适合的方法；从重复(药典)方法来说，理解好各个要素的影响，就能解决好过程中无法重现的问题。今天，我们就来谈谈液相日常应用三要素之一样品。
1、样品组成的考虑
由于待测样品的组成具有唯yi性，所以对于方法开发，哪怕只是其中一个组分有差异，也可能导致所开发的方法不一样。
比如，对于以下结构：
由于结构的相似性，为同系物，结构差异较少，三个组分均为中性化合物，故我们考虑的是常规色谱方法能否有效分离含这三个结构差异较小的组分的样品。
而对于类似的上述另外三个组分，甲苯和丙苯由于结构上的差异，分离是没有问题的。我们更多的应该考虑2-苯丙酸是否能与甲苯有效分离。(实际上两者是较好分离的)。
对于另外一组类似的三个组分，更多的困难在于苯丙氨酸的有效保留问题，以及苯丙氨酸的拖尾问题。
从上述三个简单的小栗子可以看出，尽管样品的组成都类似，但是由于样品组分组成的差异，对于分析所需要关注的点和所需解决的困难是有差异的。从DoE的角度来说，开发一个合适的方法，首先需要对样品中的组分进行剖析，根据各组分性质，开发合理的分析方法：
极性小的组合：确保各组分能全部洗脱；
极性大的组合：确保各组分能有效保留；
极性差异非常大的组合，综合考虑，折中取舍，可选择多套方法以同时满足要求；
看到组分组成的时候需要考虑很多的可预见性问题：选择的分离模式，选择的流动相组成，选择的固定相。
对于大部分的药物来说，都是可电离的，电离的程度关系到组分的疏水保留。对于酸碱化合物，电离情况如下所示：
各化合物解离的程度与疏水保留的关系如下曲线所示：
上图中，红色方框中为稳定保留区域，pKa附近，微小的pH变化都能导致保留时间较大的差异，对于中性化合物来说，在整个pH范围区间内保留均较稳定。
2、样品浓度的选择
我们知道，对于一个药品的杂质谱，其各个杂质的限度是有差异的，根据ICH或者药典标准，各已知杂质均有各自对应的限度。又因为各个杂质在确定的分析方法下响应不一致，故其定量限也是不一样的。能否对每一个杂质都能准确定量，取决于响应低的杂质是否满足定量要求。若样品浓度过低，在有关物质(杂质)检测中会导致灵敏度不够，无法满足定量限低于报告限的要求。
若浓度选择过高，对于主成分含量的测试，则导致方法学验证中含量不呈线性；对于有关物质来说，特别是主峰后的一些杂质，会因为主成分拖尾而导致准确度无法满足要求；另外，一般情况下，会用流动相来进行稀释，若主成分浓度太高，则会改变供试品的溶液环境，使其中带检测的某一组分出峰与其对照品有差异。
3、样品稀释剂的选择
说到样品的稀释剂，这是咱们分析人员常碰到的问题，也是熟悉的问题。但凡做分析的小伙伴，都能对溶剂效应道出个123来。
对于溶剂效应，小伙伴们的第yi反应肯定是在反相色谱分析过程中，由于用纯乙腈/纯甲醇等高比例有机相溶解样品，然后在进样后发现色谱图中处于前面的峰发生裂峰的问题。这是由于供试品中的溶剂强度高于流动相的关系。解决方式除了可以换稀释剂外，还可以尝试减少进样量来进行改善。
另一种溶剂效应是由于样品的加入，导致供试品的pH和流动相的pH差异较大，导致流动相无法在短时间内让进样的供试品达到平衡而导致出峰异常，包括峰形异常和出峰时间与对照品有差异。
稀释剂的选择还可能会造成盐析。特别是对于一些从原料药方法衍生而来的针对制剂的检测方法。由于制剂中辅料成分相对更加复杂，某些原料药使用的稀释剂可能会让制剂供试品产生盐析，导致出峰异常或者影响组分的回收率，影响检测的重现性，甚至导致色谱柱及仪器堵塞。
后一种情况则是由于溶出等特殊情况，导致供试品溶液中有其他成分，如SDS等，干扰测试，导致出峰异常；或者是由于溶出液pH不一致，导致的出峰异常，这个情况与前述的pH不一致归因一致。
