制备色谱技术与操作资料

制备色谱技术与操作；半制备HPLC：仪器管路粗，进样体积大（可达1m；制备色谱柱和填料：玻璃柱和不锈钢柱，填料可为硅胶；亲水样品选择正相固定相；大分子选择离子交换色谱固定相；碳水化合物选择疏水色谱固定相；无机离子选离子色谱固定相；合成聚合物选凝胶色谱固定相；立体异构样品选环糊精固定相；外消旋样品选手性固定相；样品前处理：萃取、过滤、结晶、固相萃取；装柱方法：
制备色谱技术与操作

半制备HPLC：仪器管路粗，进样体积大（可达1mL以上），进样量大（一般可达到几十毫克），检测池大，泵耐压大，流速高（可达10mL/min甚至更高），柱子内径3cm~100cm，含馏分收集器，可以制备样品进行其它定性检测，或接分析柱也可进行HPLC分析。

制备色谱柱和填料 ：玻璃柱和不锈钢柱，填料可为硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶，对硅胶进行硝酸银（或缓冲液）处理可提高分离效果。疏水样品选择反相固定相

亲水样品选择正相固定相

大分子选择离子交换色谱固定相

碳水化合物选择疏水色谱固定相

无机离子选离子色谱固定相

合成聚合物选凝胶色谱固定相

立体异构样品选环糊精固定相

外消旋样品选手性固定相

样品前处理：萃取、过滤、结晶、固相萃取。

装柱方法：颗粒直径小于20－30um的固定相采用湿法装填，使相对稀松的固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。柱直径大于20mm，所加压力为30－40bar时，采用柱长压缩技术，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧，如径向压缩和轴向压缩。

流动相：色谱分离后要旋转蒸发溶剂，不宜采用高毒性溶剂，少用多元溶剂，溶剂的纯度也要考虑。碱性流动相不能用于硅胶柱，酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统，离子交换树脂＆排阻色谱遇到某些有机溶剂会膨胀或收缩，从而改变柱床的性质。流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。 流动相选择方法（1）由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。（2）三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。

（3）粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

加样： 可采用注射器进样、旋转阀进样、六通阀进样、主泵进样、辅泵进样或固体上样。 检测器： 一般的分析池的zui大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的

zui大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。

1 问: 我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。

可以配一个PDA，另外加一个示差折光410，另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速zui大为20mL/min，一般可以配20mm ID的制备柱，一次分离10-100mg的样品，如果样品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性，配上Fraction II 馏分收集器。如果样品数量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或U号自动收集馏分。zui大通量每天可以处理100-200个样品。

2 问： 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent 1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。）

(1)制备用的流动相等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

(2)使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算，检测器的响应时间设到zui小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

3 问：我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,梯度和柱子?

RP-HPLC的C18柱可以制备很少量的肽，如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，根据峰形逐渐放大纯化的方法。 4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？

（1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长

时间使用可能影响柱子寿命。（2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。（3）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。

5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？

（1） 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较好的溶解度。（2）样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶。

（3）不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。（4） 可以固体上样。 6 问：多肽的分离制备, 如何上量？如何增大分离度?

反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流动相，看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。

关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。我们先在分析柱（4.6MM内径）上做一下实验,找到zui大的分离度,这一过程的难度是zui大的,要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。

还可以考虑离子交换来分离多肽。

7 问： 做柱层析时（国产大孔吸附树脂），怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净？ 大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收；或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。

8 问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整？是否可以按照柱体积折算只改变流速？其上样量多大为宜？

（1）泵要换，流量要加大，压力可不变或减少；流通池要换体积更大的。

（2）整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路，增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致峰展宽。

（3）检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准。

（4）上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料）；一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。

9 问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐？选用挥发性酸，碱或盐（如醋酸铵）是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去？

一般可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。但也是稍微麻烦的事情，，不加酸碱盐，如果要加的话，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。 可用G25脱盐，它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时，一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。

10 问：制备型柱子柱压上升、柱效下降怎么办？

堵塞柱子的原因：

（1） 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高，

（2） 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。

（3）流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？

柱子再生办法：

（1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。（2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，但一般将大大降低柱子效果。

（3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污染柱子）

11 问：制备柱柱跑干了影响柱效吗?

如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低. 具体造成影响有多大，要靠柱效测定来确定，而不是干柱时间的长短。如果跑干了，对于PUMP的影响可能还大些，所以先把管路中的空气抽走。

12 问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相可以重蒸使用吗？

流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量，计算后再使用。

要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲，实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。

13 问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？

TFA是反相色谱分离中常用的添加剂，可以用冻干的办法去除，还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好，还可以起到浓缩样品的作用。 首先，冻干的办法应该可以几乎*地除去TFA和乙腈，药物实验前先检测一下冻干品中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是zui简单有效的。

其次，如果你的药物的分装量不大的话(<100ug)，建议你用离子交换层析，装一个小一点儿的柱子，让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上，稀释后*符合试验要求。如果用分子筛，考虑稀释，也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话，可能会形成TFA盐，这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗，然后将产品萃取出来。或者在里面加入一定量的盐酸，再干燥后形成盐酸盐。

14 问：同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？ 一般会有一定的变化，原因有以下几点

（1）制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。

（2）如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。

（3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。

15 问：反相色谱分离后，如何快速从流动相中得到产品？

可以考虑先在低温下，减压旋蒸除去其中的有机溶剂，然后用萃取的方法把产品萃取出来，然后再低温再旋蒸，这样，就可以不将温度升得很高而得到产品。 如果要直接蒸掉流动相，水泵的真空度要注意（要检查气密性），否则蒸水会很慢。一般比较好的泵在60-70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行，这样容易暴沸导致样品损失。另为，温度太高可能引起物质变性。